（2）体外转录法　设计针对靶序列的正义链和反义链，分别在其上游接上T7启动子，进行体外转录获得单链RNA，杂交后形成dsRNA，然后在体外用RNA酶消化，从而获得siRNA。这样制备的RNAi，成本相对于化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。此法虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但其实验规模受到限制，最适用于筛选siRNAs。

（3）RNase III　用KNase Ⅲ消化长片断双链RNA制备siRNA。这种方法通常是先获得目的基因的200～1 000个碱基的模板，用体外转录的方法制备针对此序列的长片断双链dsRNA ， 然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一组siRNAs“混合鸡尾酒”。除掉没有被消化的dsRNA 后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞。dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过设计和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱，缺点是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。但目前多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。

（4）质粒载体介导的细胞内表达siRNA法　载体常用的启动子有T7、Hl2RNA、人Val2tRNA、U5、U6等。这些表达载体是通过添加一串(3到6个)T来终止转录的。在转染了哺乳动物细胞后，可将插入序列设计成含基因特异序列的反转重复序列，它在体内表达后自发形成小发卡RNA ( small hair2p in RNAs， shRNA ) 。shRNA 继而被加工成siRNA分子，执行特异基因的沉默。要使用这类载体，一般需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA 单链，退火为双链，克隆到相应载体的pol III启动子下游。这种方法产生的siRNA能够更长时间地抑制目的基因的表达，这种方法至今多限于体外细胞系研究。最近多个厂家开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。最适用于已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞和长期研究。缺点是需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作。表达siRNAs的载体常用设计形式见下图。其核心是U6或其它RNA 聚合酶III启动子，正义链，loop环，反义链，聚合酶III终止子，连续4 个或5个T。在动物细胞内它可以转录形成发夹样结构，这种结构可被Dicer酶加工，产生siRNAs，并激活RNAi。目前表达siRNAs的载体已经广泛应用到多种哺乳动物细胞中，包括HeLa3293 /EcR以及小脑颗粒神经元细胞等等。

（5）siRNA表达盒细胞内表达法　siRNA表达盒( siRNA exp ression cassettes， SEC)是一种由PCR 得到的siRNA表达模板盒，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这种方法最早由Cas2tanotto及其同事采用，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点(下图)。SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到。因此， SECs成为筛选siRNA的最有效工具，如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。此方法最适用于筛选siRNA序列。