目前普遍认为生物中自然存在RNAi的作用是:在动植物中作为基因组免疫系统( Genomeimmune system)有效防止外源有害基因如病毒的侵入,另外也是基因表达调控的一个重要途径。
功能基因组的研究
在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或降低突变,以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性,可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低的突变,因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具用于功能基因组的研究。
疾病治疗
将RNAi用于疾病相关基因的抑制,从而达到治疗或预防疾病的目的。例如在抗肿瘤治疗中, RNAi可用于抑制癌基因的表达;在治疗病毒性疾病的研究中,可以设计针对病毒基因组RNA的siRNA或针对宿主细胞病毒受体的siRNA来抗病毒,目前针对乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒( in2fluenza virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、H IV - 1、SARS病毒等均取得了令人欣喜的体外病毒抑制作用。但是由于目前基因治疗普遍缺少高效低毒的转运载体,限制了RNAi在体内的应用。
siRNA试验步骤
1 siRNA的设计
首先检索感兴趣的核苷酸序列,并了解各个片段的功能。靶序列通常被选择在一段mRNA序列起始密码子下游第50~100个碱基后面。在设计siRNA 时往往会选择符合AA(N19) TT(N,任意碱基)的一段23 bp的基序,再从中筛选G/C含量在30%~50%左右的序列。但往往并非绝对如此。为了确保满意的RNAi实验效果,建议设计2条以上不同序列的siRNA。上述设计没有考虑mRNA的二级结构。研究表明,相对于反义RNA 和核酶技术,mRNA 二级结构对siRNA的作用没有明显的影响。
病毒易于变异,因此设计的siRNA必须与目的mRNA完全匹配,一个碱基突变或者左右移动一个或几个碱基都会造成RNAi的抑制效果明显下降或消失。
以下几点需要注意: ①使用Pol III启动子进行转录时,如遇上4个碱基的T或A的连续结构(即TTTT或AAAA)时,其转录反应会被终止。因此,靶点内部具有4个碱基的T或A的连续结构的序列不适用于使用Pol III启动子的表达载体。②具有G或C的4个碱基以上的连续结构(即: GGGG或CCCC) ,容易形成复杂的立体结构,最好不要使用。③注意设计特异性较好的序列,不要设计和其它基因具有较高同源性的siRNA 序列, 最好用BLAST程序进行同源性比对。RNAi免费设计软件可以在Ambion等公司的网站上查到。
2 siRNA的制备
(1)化学合成法 目前使用得比较广泛的是siRNA双链复合体。siRNA 双链复合体是根据靶mRNA序列设计的21个核苷酸的双链,由一条正义链和反义链组成,其中正义链19个核苷酸序列与靶序列相同, 3’端有2 个碱基突出,一般为UU或dTdT,反义链19 个核苷酸序列与正义链互补,3’端也有2个碱基突出,一般为dTdT或UU, 3’端dTdT结构对siRNA双链复合体的稳定性有很大贡献,而UU结构有利于siRNA介导的基因沉默。见下图。 目前已有多家公司可以提供siRNA化学合成服务。在哺乳动物细胞中70% ~80%有RNAi作用,主要的缺点是价格比较高。
化学合成siRNA的设计
(2)体外转录法 设计针对靶序列的正义链和反义链,分别在其上游接上T7启动子,进行体外转录获得单链RNA,杂交后形成dsRNA,然后在体外用RNA酶消化,从而获得siRNA。这样制备的RNAi,成本相对于化学合成法而言比较低,是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。此法虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但其实验规模受到限制,最适用于筛选siRNAs。
(3)RNase III 用KNase Ⅲ消化长片断双链RNA制备siRNA。这种方法通常是先获得目的基因的200~1 000个碱基的模板,用体外转录的方法制备针对此序列的长片断双链dsRNA , 然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化,得到一组siRNAs“混合鸡尾酒”。除掉没有被消化的dsRNA 后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞。dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过设计和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱,缺点是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。但目前多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
(4)质粒载体介导的细胞内表达siRNA法 载体常用的启动子有T7、Hl2RNA、人Val2tRNA、U5、U6等。这些表达载体是通过添加一串(3到6个)T来终止转录的。在转染了哺乳动物细胞后,可将插入序列设计成含基因特异序列的反转重复序列,它在体内表达后自发形成小发卡RNA ( small hair2p in RNAs, shRNA ) 。shRNA 继而被加工成siRNA分子,执行特异基因的沉默。要使用这类载体,一般需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA 单链,退火为双链,克隆到相应载体的pol III启动子下游。这种方法产生的siRNA能够更长时间地抑制目的基因的表达,这种方法至今多限于体外细胞系研究。最近多个厂家开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。最适用于已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞和长期研究。缺点是需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作。表达siRNAs的载体常用设计形式见下图。其核心是U6或其它RNA 聚合酶III启动子,正义链,loop环,反义链,聚合酶III终止子,连续4 个或5个T。在动物细胞内它可以转录形成发夹样结构,这种结构可被Dicer酶加工,产生siRNAs,并激活RNAi。目前表达siRNAs的载体已经广泛应用到多种哺乳动物细胞中,包括HeLa3293 /EcR以及小脑颗粒神经元细胞等等。
(5)siRNA表达盒细胞内表达法 siRNA表达盒( siRNA exp ression cassettes, SEC)是一种由PCR 得到的siRNA表达模板盒,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这种方法最早由Cas2tanotto及其同事采用,包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点(下图)。SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到。因此, SECs成为筛选siRNA的最有效工具,如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。此方法最适用于筛选siRNA序列。
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