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【Nature重磅】失眠?可能是这些细胞不配合!科学家用病毒示踪和RNA测序精确定义了睡眠神经元

睡眠一直以来是人们比较感兴趣的研究课题,因为人的一生大约有1/3的时间是在睡眠中度过的。睡眠是每个人生命中的必需品,但它也困扰了很多人的日常生活。



近几十年,随着脑电记录技术的发展,人们发现睡眠过程并不是一成不变的。从脑电的检查结果来看,正常人在睡眠时,存在两种截然不同的现象:有时眼球快速来回活动,被称作快速眼动期睡眠(REM),有时眼球不活动或者只有很慢的浮动,被称作非快速眼动期睡眠(NREM),同时脑电活动也出现了不同的变化。



虽然,我们对睡眠的不同阶段有了一些了解,但是对睡眠的脑机制尚不清楚。当前研究发现表明,如果脑中的下丘脑视前区(Preoptic area, POA)发生了损伤,会导致严重的睡眠障碍,这说明视前区在睡眠的产生中起到重要的作用。然而,到底是哪些神经环路促进了睡眠很不清楚,尤其是睡眠神经元和清醒相关神经元在空间上并没有明显区分,这给人们研究特定的睡眠神经环路制造了难度。

这种情况下,鉴定和发现特定的睡眠相关神经元显得尤为重要。最近,Nature发表了UC Berkeley的丹扬教授最新发现。他们基于投射通路分离了一类POA睡眠神经元,并鉴定了这类细胞的特定分子标记[1]。

研究思路和结果

1.利用c-Fos检测找到睡眠相关的神经元

要详细分析睡眠的神经环路,我们首先得找到与睡眠相关的神经环路。文中,作者首先在动物睡眠和清醒状态下,检测POA神经元c-Fos表达量(表征神经元的活动)。通过c-Fos与逆标染料的结果,作者发现POA投射到TMN(组胺能结节乳头核)的神经环路与睡眠相关(图1a);而且, GABA能的中间神经元在此过程中更重要(图1b)。因此,后面的实验围绕这条GABA能神经元介导的POA-TMN神经通路(GABAPOA→TMN)展开。



图1 GABAPOA→TMN神经元参与睡眠

2.光遗传技术操控特定神经环路,研究睡眠行为的变化

作者接下来在GAD2-Cre小鼠(GABA能神经元特异表达Cre)TMN脑区注射能够逆向标记的病毒rEIAV,在GABAPOA→TMN神经元表达ChR2(照光兴奋)或iC++通道(照光抑制)。随后,作者通过电生理记录检测动物的睡眠状态(即REM\NREM\Wake状态),并利用激光激活或抑制GABAPOA→TMN,发现睡眠行为分别发生了增强或减弱(图2)。



图2 光遗传技术操控GABAPOA→TMN神经元改变睡眠

3.光遗传激活POA的GABA能神经元会增强觉醒

既然GABAPOA→TMN神经元能够控制睡眠行为,那么直接激活POA中神经元是否就能催眠?于是,作者在GAD2-Cre或VGLUT2-Cre小鼠POA注射AAV-DIO-ChR2,在GABA神经元或谷氨酸能神经元表达ChR2,同时使用激光激活这些细胞和电生理记录。结果与预想的相反,激活这些神经元反而促进了动物的觉醒状态(图3)。



图3 激活POA脑区GABA能神经元或谷氨酸能神经元促进觉醒

4.光电极记录鉴定睡眠相关的GABAPOA→TMN

上述“矛盾”是怎么回事?作者接下来通过光电极记录手段(光纤+多通道记录),鉴定了一些能够被激光激活的POA区GABA能中间神经元(GABAPOA→TMN),结果发现这些神经元在睡眠中大量活动(图4),这进一步说明GABAPOA→TMN与睡眠密切相关。



图4 POA-TMN的GABA能神经元在睡眠时活动

5.通过RNA测序发现睡眠神经元的标志物

然而,仅仅知道睡眠时活动的神经元是远远不够的,我们还想知道哪些神经元具有促进睡眠的功能?

因而,作者最后使用单细胞RNA测序和翻译核糖体亲和纯化(translating ribosome affinity purification,TRAP)技术鉴定了GABAPOA→TMN 神经元的标记物。通过大量筛选,他们发现肠促胰酶肽(CCK)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)以及速激肽1(TAC-1)能够特征性标记促进睡眠的神经元(图5)。




图5 POA睡眠神经元的新分子标记

总结

丹扬教授的研究使用病毒逆向追踪的手段鉴定了睡眠相关的GABAPOA→TMN通路,同时结合RNA测序技术找到了促进睡眠的视前区神经元标记物。这项工作除了为我们提供了研究功能相关神经元的范例,还为未来的研究提供了标记促睡眠神经元的工具。

参考文献

1.Chung S, Weber F, Zhong P, Tan CL, Nguyen TN, Beier KT, et al. Identification of preoptic sleep neurons using retrograde labelling and gene profiling. Nature. 2017.
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