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Nature:操纵Cas9的REC3结构域可大幅降低CRISPR-Cas9的脱靶效应


图片来自Janet Iwasa graphic for Doudna Lab。

2017年9月22日---在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校、麻省总医院、哈佛医学院和劳伦斯伯克利国家实验室的研究人员鉴定出Cas9蛋白中的一个关键区域决定着CRISPR-Cas9如何精准地对靶DNA序列进行编辑,对它进行微调可产生超精准的基因编辑器,并且使得该基因编辑器的脱靶切割(off-target cutting)活性降低到有史以来的最低水平。相关研究结果于2017年9月20日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy”。论文通信作者为加州大学伯克利分校分子与细胞生物学教授、霍华德-休斯医学研究所研究员Jennifer Doudna博士。

在CRISPR-Cas9中,Cas9蛋白起着结合和切割DNA的作用。这些研究人员说,他们鉴定出的这种蛋白区域作为DNA切割的一种主控制器发挥作用,是对Cas9进行重新设计进一步提高它的切割精准度的一种显而易见的靶标。这种方法应当有助科学家们定制设计Cas9变异体,从而使得CRISPR-Cas9在错误位点上对DNA进行编辑的几率最小化。当利用CRISPR-Cas9在人体进行基因治疗时,这是一个关键的考虑因素。

一种提高精准度的策略是在这种控制性的被称作REC3的蛋白结构域中引入突变,然后观察哪些突变会提高精准度,同时不会影响在靶切割(on-target cutting)的效率。

论文共同第一作者、Doudna实验室研究生Janice Chen说,“我们发现即便Cas9的REC3结构域发生微小的变化也会影响在靶编辑和脱靶编辑之间的差异,这提示着这个结构域明显是通过深入地诱发突变来改善靶向特异性的候选者。作为这项研究的延伸,相比于我们之前开展的靶向突变,我们能够在REC3结构域中更加无偏向性地引入突发。”其他的论文共同第一作者为加州大学伯克利分校的Yavuz Dagdas和哈佛医学院的Benjamin Kleinstiver。

超精准的Cas9

2012年,Doudna和德国马克斯-普朗克感染生物学研究所的Emmanuelle Charpentier将Cas9蛋白改作他用,构建出一种便宜的、廉价的和易于使用的基因编辑器。从那以后,人们就已寻求降低脱靶编辑的几率。尽管改进的保真度有利于开展基础研究,但是当将基因编辑用于临床应用时,这是至关重要的,这是因为任何脱靶DNA切割可能让关键基因丧失功能,从而导致永久性的和意想不到的副作用。

在过去的两年里,两个研究团队构建出高度精准的Cas9蛋白:一种特异性增强的Cas9,即eSpCas9(1.1);一种高保真度的Cas9蛋白,即SpCas9-HF1,而且Chen和Doudna试图了解为何它们要比如今广泛使用的来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的野生型Cas9蛋白更高特异性地切割。

当前,使用CRISPR-Cas9的科学家们构建出单向导RNA(sgRNA)---一种RNA分子,含有长20个核苷酸的RNA片段,而且该片段与想要靶向的长20个核苷酸的特定DNA序列互补---并且将它附着到Cas9上。这种sgRNA允许Cas9蛋白靶向互补的DNA序列,结合并切割它。但是这种Cas9-sgRNA复合物也能够结合到不那么精确匹配的DNA上,从而导致不想要的脱靶切割。

2015年,Doudna实验室发现了Cas9的一种构象开关,当sgRNA与靶DNA匹配时,这种构象开关会被激活(Science, doi:10.1126/science.aac6572; Nature, doi: doi:10.1038/nature15544)。他们已发现仅当这种sgRNA与靶DNA严格匹配时,Cas9的三维结构,特别是它的HNH核酸酶结构域构象,会发生改变,从而激活Cas9的切割活性。然而,负责识别这种构象开关上游的这些核酸的过程仍然是不为人知的。

在当前的这项研究中,Chen和Dagdas利用一种被称作单分子荧光共振能量转移(single-molecule FRET, smFRET)的技术准确地测量当Cas9-sgRNA复合物结合到靶DNA上时,这种复合物中的多种蛋白结构域,特别是REC3、REC2和HNH结构域,如何移动。

他们首先确定了eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1提供的特异性益处能够根据这些Cas9变体中的HNH构象开关的激活阈值要比野生型Cas9蛋白高得多从而使得当结合到脱靶序列上时eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1变体更不可能激活Cas9的切割活性的事实加以解释。

接着,他们发现REC3结构域负责检测靶标结合的精准度,随后这会指示REC2结构域向外旋转而为HNH核酸酶结构域打开一条通路,从而激活Cas9的切割活性。具有这种活性构象的Cas9随后能够切割靶DNA的双链。

Chen、Dagdas和Kleinstiver随后证实通过让REC3的部分片段发生突变,就有可能改变Cas9蛋白的特异性,使得HNH核酸酶结构域不会被激活,除非这种sgRNA与靶DNA非常严格地匹配。他们能够设计出一种改进的超精准的Cas9(被称作HypaCas9),这种HypaCas9保留了它的在靶切割效率,但略微更好地区分人细胞中的在靶位点和脱靶位点。

Chen说,“如果让REC3中的某些氨基酸残基发生突变,那么人们就能够调整Cas9的在靶切割活性和改进的特异性之间的平衡;我们能够找到这样的一个甜美的平衡点,从而确保在预定的靶标上具有足够的切割活性,同时大幅降低脱靶事件。”

通过继续探究Cas9的结构、功能和动力学之间的关系,Doudna和她的团队希望能够进一步地对这种蛋白进行高度灵敏地改造,从而利用它可靠地和高效地产生多种遗传变化。

参考资料:

Janice S. Chen, Yavuz S. Dagdas, Benjamin P. Kleinstiver et al. Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy. Nature, Published online 20 September 2017, doi:10.1038/nature24268

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