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钠磷协同转运蛋白与慢性肾脏病矿物质和骨异常

文章作者:朱伟平 李中 史伟


随着慢性肾脏病(CKD)的进展,肾小球滤过率降至30ml/(min-l.73m2)后,肾小管对隣的重吸收减少至低限,磷的排泄不再增加,于是出现高磷血症,并刺激甲状旁腺细胞增生,甲状旁腺激素(PTH)分泌增加,持续高水平的PTH增加破骨细胞活性,促进骨吸收,使破骨与成骨过程之间的平衡失调,导致矿物质和骨异常(CKD-MBD)。


以往对CKD-MBD的研究主要集中在钙离子代谢紊乱,近年研究发现CKD患者血清磷水平与血管钙化、心血管死亡的风险存在明显相关性,从而引发人们对磷代谢的关注。


高磷血症的危害


正常饮食摄入的磷为1000-1200mg/d,经肠道排泄约150mg/d,其余主要通过尿液排出体外。其实CKD患者早期已经存在磷酸盐代谢紊乱,只是肾小球滤过率>60ml/(min.1.73m2)时,磷的高负荷状态往往容易被忽略,直至出现高磷血症。


而CKD晚期患者肾脏已丧失排泄功能,依赖于透析进行清除体内的磷酸盐。然而遗憾的是,无论是血液透析或腹膜透析(前者清除约300mg/d,后者清除约423mg/d),都不能充分清除体内的无机磷。


已有体外试验证实,胞外高水平的磷酸盐可以刺激平滑肌细胞转分化为成骨样细胞,继而出现钙化。Yamamoto等观察到磷负荷可损害血管内皮功能,导致左心室质量增加。


临床横断面研究也证明透析患者的高磷血症与血管钙化密切相关。最近一项涉及47个队列研究共327644例患者的荟萃分析发现,血清磷水平每升高1mg/dl,死亡风险增加18%。


另一项对25588例血液透析患者的前瞻性研究提示,血清磷水平3.6~5mg/dl者心血管死亡风险较低,而血清磷水平超过7mg/dl者心血管死亡风险最高。因此,高磷血症是血管钙化、左心室肥厚和心血管死亡事件的危险因素。


钠磷协同转运蛋白(Npt)


无机磷参与细胞结构的组成和许多重要的生物功能,包括存储和释放能量的代谢,氧气运送至外周组织,肌肉收缩,神经系统的功能,电解质的运输和维持骨的完整性。


无机磷酸盐在细胞中活跃地进行逆化学和电势梯度跨细胞膜运输。在哺乳动物细胞中,这个任务是由Npt完成,利用Na+浓度梯度所提供的自由能作为驱动力,增加磷的摄入。


Npt的表迖目前至少已从哺乳动物细胞分离出Npt-l、Npt-2、Npt-3三种Npt。Npt-1的基因位于染色体6p22,由465个氨基酸组成,最早是从兔子的肾皮质分离出来,主要表达于肝脏、肾脏和大脑。


Npt-2包括2a、2b和2c三种亚型。Npt-2a在大鼠、人、负鼠和小鼠分别曾被命名为NaPi-2、NaPi-3、NaPi4、NaPi-7,其基因位于染色体5q35,含640个氨基酸,主要表达于近端肾小管上皮细胞的顶膜,在大脑、软骨细胞和破骨细胞中也有少量表达;Npt-2b的基因位于4号染色体,在非洲爪蟾亦称为NaPi-5,含690个氨基酸,定位于肠上皮细胞的顶膜;NPt-2c的基因位于2号染色体,含601个氨基酸,主要在肾脏表达。


NPt-3蛋白最初是在1990年被O’Hara等研究者作为长臂猿白血病病毒受体(GLVR1)在小鼠和人类中分离出来,而在大鼠中是以双嗜性小鼠逆转录病毒的受体(Ram-1)分离出来。


根据发现的这些病毒受体的功能特性,GLVR1和Ram-1分别被称为Pit-1和Pit-2,其基因分别位于2、8号染色体,均含683个氨基酸,分布在细胞基底侧膜,在组织中广泛表达(如肝、肺、横纹肌、心脏、脑和骨髓)。


Pit-1mRNA在成年大鼠含有丰富的高度极化小肠和肺上皮细胞的组织中的表达最丰富,Pit-2mRNA表达水平最高的是心脏,但具有细胞类型特异性的Npt只在骨、肾和小肠中表达。Pit-1和Pit-2约有60%的氨基酸序列相同,但它们与1型或2型Npt并无显著的整体序列同源性oPit-1是由2890-bp的互补DNA编码的蛋白质,与小鼠和人的Pit-1的序列同源性分别为97%和93%。


Pit的家庭成员还包括非哺乳动物,如酿酒酵母的Pho89、大肠杆菌的质子依赖性磷转运体PiTA和PiTB、植物拟南芥的Pth2-l等。


Npt的功能及调节


NPt-l属于溶质转运蛋白家族17(SLC17)磷转运蛋白家族,在肾脏介导近端肾小管上皮细胞顶膜Na+依赖的磷转运,其功能受胰岛素的调控,但对该蛋白的深人研究较少。


Npt-1表达可诱导非洲爪蟾卵母细胞的Cl-转运,该作用可被C1-通道抑制剂阻断。在缺乏C1-的情况下,有机阴离子酚红,青霉素g和丙磺舒能诱导外向性的电流,而且此作用同样能被C1-通道抑制剂阻断。


说明NPt-i不仅是C1-的一种新型离子通道,且对有机阴离子的转移也起作用。这种在近端肾小管上皮细胞顶膜的阴离子通道对C1-的运输和生物异源性有机阴离子的排泄起重要作用研究发现NPt-l还参与大脑谷氨酸的摄取,与Npt-2不同的是Npt-1表达不受饮食中磷含量和PTH的调节,仅在细胞外存在高浓度的磷(>3mmol/L)时才产生生电性离子转运。


Npt-2属于SLC34的磷转运蛋白家族,主要转运HPO42-,在维持体内磷代谢平衡的过程中起着关键作用。大脑表达的Npt-2a在中枢神经系统Pi稳态调节中发挥作用。


NPt-2b参与肝脏初级胆汁中磷的重吸收;在唾液腺,Npt-2b还参与唾液中磷的分泌。食物中的磷主要在小肠吸收,小肠上皮细胞顶端膜的Npt-2b通过钠憐协同转运作用将憐运输至体内;而血循环中的磷主要由近端肾小管重吸收,并经肾脏形成尿液排出体外。


肾小管上皮细胞刷状缘膜顶端的NPt-2与Na+结合后发生构型改变,对磷酸盐的亲和力增强,使磷酸盐随Na+—起转运人细胞内。


肾脏通过调节尿磷重吸收保持体内磷平衡。由此可见,NPt-2a与Npt-2c是血浆磷水平和尿磷排泄的主要决定因素。


该载体受生理因素调控,例如限制磷的饮食和l,25(OH)2D3可使NPt-2a蛋白水平增加,而成纤维细胞生长因子23(FGF23)、PTH或高磷饮食可使NPt-2a蛋白水平下降。


FGF23正常为10~50ng/L,是生理性的体液因子,能抑制近端肾小管刷状缘膜上NPt-2a和NPt-2c型的表达,减少尿液中磷酸盐重吸收,增加尿磷排泄。


Moz等动物实验证明,低血磷可使大鼠近端肾小管Npt-2的mRNA表达增加,而PTH和FGF23则明显抑制Npt-2的mRNA表达。


FGF23转基因小鼠中观察到尿磷排泄增加,血磷降低,近端肾小管NPt-2a蛋白表达显著减少。而FGF23基因敲除小鼠身上可见磷的最大转运率增加,近端肾小管NPt-2a蛋白水平明显升高。


有研究表明,FGF23不仅能抑制近端肾小管的NPt-2a蛋白,同时还可以抑制肠内NPt-2b水平,但此作用可能依赖于维生素D受体。此外,1,25(OH)2D3可上调肠上皮细胞的磷转运活性和NPt-2b蛋白的水平。


哺乳动物的NPt-3是具有钠磷协同转运与逆转录病毒受体双重功能的蛋白质,属于SLC20的磷转运蛋白家族,主要转运H2PO4-。


Pit-1和Pit-2都在极化的上皮细胞的基底外侧膜上表达,能从间质液中吸收磷酸,以发挥正常的细胞功能,是几种组织磷酸盐运输的基础。碱性pH值和膦甲酸钠(PFA)对Pit-1和Pit-2均有抑制作用。


尽管Pit-1和Pit-2的基因启动子巳被克隆,但不同细胞类型的Pit蛋白的确切作用尚未明确,可以肯定的是,他们参与骨、主动脉平滑肌细胞、甲状旁腺、肾和小肠的重要生理通路。


Npt相关的疾病


除了无机憐外,Npt-1还能依赖膜内正电位转运有机阴离子,包括阿司匹林、尿酸等。当NPt-l基因发生突变使氨基酸残基中第138位精氨酸变为丙氨酸后,产生的蛋白将丧失转运这些阴离子的功能。


异源性表达和纯化的人NPt-l携带的单核苷酸多态性变异使其尿酸转运活性降低32%,痛风发生的风险增加。


NPt-2a基因敲除小鼠呈现出高磷酸盐尿表型,其功能异常可导致X-连锁低磷血症(XLH)和常染色体显性低血磷性佝偻病(ADHR),后者表现为高尿钙,低血磷,骨痛,肌肉无力,生长发育迟缓,佝偻病和骨软化。


然而,目前尚未发现与NPt-2a基因突变有关的人类疾病[33]。NPt-2a基因缺失纯合子小鼠的肾脏仍可保留30%的磷吸收功能,这部分功能可能与NPt-2c有关。


NPt-2b在附睾表达异常可引起雄性小鼠不孕不育;NPt-2b还表达于肺泡Ⅱ型细胞,并证实该基因突变将引发肺微石症。


另有研究称NPt-2b功能障碍可能导致其他组织器官中形成微细结石,特别是含有磷酸钙的微钙化乳腺组织比无憐酸盐成分者更多地呈现恶性倾向。


而NPt-2c基因的突变可导致高尿钙性低血磷性佝偻病。NPt-3的成员之一Pit-1在发育中的长骨表达非常丰富,该基因在Wistar大鼠(TG)的过表达将影响钙磷代谢,表现出低血钙、高血磷、PTH水平升高及成骨细胞碱性磷酸酶活性降低,但不影响骨骼的矿化和发育。


骨骼磷的释放


人体的骨组织中主要含有成骨细胞和破骨细胞。骨骷是一种需要不断重塑的组织,骨重塑是由骨吸收和骨形成两个过程共同协调完成,这是一个持续的生理过程,在任何的时间都有5%~25%的骨面在进行骨重塑。


骨重塑是破骨与成骨的偶联形式,两者保持着动态平衡,任何不平衡因素都会导致骨质和骨量的改变。


破骨细胞是主要的骨吸收细胞,有许多不规则的皱褶缘呈波浪型接触骨的表面,并经整合素结合到骨的表面,包围吸附区的骨质,然后通过碳酸酐酶Ⅱ系统产生氢离子,胞质膜上的质子泵将胞质中的氢离子泵至破骨细胞与骨质之间的间隙中,降低局部的pH值,使羟磷灰石晶体溶解成无定型的磷酸钙,并进一步释放出钙与无机磷,基质中的有机成分则被酸性蛋白水解酶分解 (图1)。


当骨吸收减弱时,破骨细胞从吸收窝消失,成骨细胞则在骨面准备利用钙与无机磷合成羟磷灰石,形成新骨。随着成骨细胞在骨吸收窝的形成,骨重塑周期结束,骨质保持休眠状态,直到下一个周期。


成骨细胞与Npt


无机磷是骨形成的关键。在成骨细胞中磷运输主要是由Na+依赖性磷转运蛋白完成的。目前在成骨细胞仅鉴别出NPt-3。Palmer等研究表明Npt3参与软骨细胞和成骨细胞的矿化和异位钙化。


另一项对培养未转化的细胞系小鼠胚胎成骨细胞系(MC3T3-E1)向成骨细胞分化过程中Pit-1和Pit-2稳态mRNA水平的研究发现,Pit-2mRNA总是在较低水平表达,Pit-1mRNA水平则在成骨细胞分化过程中伴随着骨钙素mRNA增加而增加。


此外,Pit-1mRNA水平的增加也与培养的成骨细胞可观察到矿化的时间有关,仅在适合成骨细胞分化的生长条件下观察到Pit-1mRNA表达水平随着时间的推移而增加。


证明成骨细胞分化的调节依赖于Npt的表达。Pit-1和Pit-2都参与前成骨细胞和成骨细胞的磷运输,Pit-1介导的磷转运与成骨细胞的分化有关,可作为成骨细胞成熟的标记。


Suzuki等在Pit-1转基因大鼠上观察到Pit-1过表达影响大鼠骨和钙磷的代谢,血清钙离子浓度的下降与血清PTH水平增加有关,血清磷的变化与FGF23呈负相关,而l,25(OH)2D3并未受到Pit-1过度表达的影响;


同时,TG大鼠颅盖骨成骨细胞磷的吸收增强,伴碱性磷酸酶的活性显著下降,钙的沉积和胶原基质的钙化正常,骨矿化和骨形成并不受影响。


破骨细胞与Npt



破骨细胞是负责骨吸收的主要细胞,在骨吸收的过程中暴露于高浓度的无机磷环境,它们拥有特殊的磷运输系统能够处理骨吸收过程中释放出的磷,限制磷摄入可减少体外破骨细胞介导的骨吸收。


Gupta等应用大鼠的多克隆NPt-2抗体发现破骨细胞表达Npt-2a,这种蛋白质的分子量约95kD,定位于非极化破骨细胞的离散囊泡。


该研究的免疫荧光结果提示这种蛋白质在极化的破骨细胞中只分布在基底外侧膜,并与Na/H泵共处于一个区域。后来证实破骨细胞Npl-2的cDNA序列与近端肾小管的相同,并不是其异构体。


敲除NPt-2基因的纯合子(NPt2_A)的小鼠展现出与年龄相关的独特骨表型,表现为骨畸形、破骨细胞减少和低磷血症。


此外,Khadeer等通过RT-PC1-分析在小鼠破骨细胞中发现,一个Npt家族成员Pit-1的表达分布在极化破骨细胞的基底外侧膜,类似于破骨细胞中Npt2a的分布,且破骨细胞中Pit-1可能与肾脏中发现的相同。


Ito等在研究由核因子kB受体活化子配体(RANKL)诱导单核巨噬细胞(RAW264.7)分化而来的破骨细胞样细胞时观察到,在未分化的单核巨噬细胞中磷进入细胞是Na+依赖性的,加入RANKL后钠磷转运显著增加;


与中性pH值相比,pH值5.5时破骨细胞样细胞Na+依赖性磷运输系统的活性显著增强,骨颗粒也显著增加破骨细胞样细胞的Na+依赖性磷转运活性。


但有趣的是,经免疫组化和WesternBlot检测出这些Na+依赖性磷转运体是Npt-3,而NPt-2a的表达是阴性的。


无论是NPt-2a或是Npt-3,它们都有强大的Na+依赖性磷转运特性,由此推测磷转运的目的可能是为破骨细胞骨吸收提供所需的能量底物。


综上所述,Npt是体内无机憐的一种重要转运蛋白,维持矿物质和骨代谢稳定的成骨细胞和破骨细胞表面都有Npt表达并承担无机磷转运的任务。通过对Npt参与体内磷代谢调控机制的研究,可能为矿物质和骨代谢紊乱的治疗带来新的切人靶点。


肾脏病与透析肾移植杂志 第22卷第6期2013年12月

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