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ETS-1在系统性红斑狼疮发病机制中的作用

文章作者:任启洁 李向培


系统性红斑狼疮(systelllic lupus erythematosus,SLE)是--种慢性系统性自身免疫病,以多种自身抗体的产生、补体激活和免疫复合物的沉积为特点。SLE的发病受遗传和环境因素的双重影响,目前发病机制仍不十分清楚。


转录因子(transcription factor,TF)是一类具有特殊结构的蛋白质分子,具有直接结合或间接作用于基因启动子、形成具有RNA聚合酶活性的动态转录复合体、调控目的基因表达的功能。近年来由于其在免疫细胞分化中的关键作用而越来越受到重视。


ETS-1是ETS(E26 transformation specific)转录因子家族中的一员,研究表明ETS在自身免疫病的发病过程中发挥了重要的作用。近年,两个全基因研究小组分别发现ETS-1与SLE具有相关性,提示ETS-1可能在SLE的发病机制中起了重要作用。多项研究结果提示ETS-1可能参与SLE的发病。本文综述了近年ETS-1在SLE发病机制中作用的研究,以期为SLE发病机制研究提供新的思路。


1 ETS-1的结构及功能


ETS转录调控因子最早是在鸟骨髓成红细胞增多症病毒E26所表达的融合蛋白中发现的癌基因v-ets。随后,ETS家族其他成员被陆续发现。每一个ETS家族成员均含有一段高度保守的同源序列-ETS结构域。


该结构域同时也是一个DNA结合域,并包含了一个共同的核心——三核苷酸密码子GGA。这段结合域由85个氨基酸构成,它可以介导DNA特异性的结合到GGA核心片段。该段结构域含有一段螺旋-转角-螺旋结构的侧翼序列。


ETS-1的mRNA通过限制性剪切作用可以产生3种不同亚型的蛋白——完整蛋白P51或P54、缺乏外显子Ⅲ-Ⅵ编码的蛋白P27以及缺乏外显子Ⅶ编码的蛋白P42。


P27蛋白具有显性失活功能,不能激活自身的转录,却能够抑制P51蛋白的转录。ETS-1的P42亚型是一个功能蛋白,它缺乏自抑制片段,自抑制片段是存在于ETS-1氨基末端的一段特殊的抑制序列,可以抑制ETS-1结合到DNA上。


这种抑制作用受转录因子和激酶的影响,如转录因子急性髓系白血病基因_1(AML-1)可以通过这个抑制片段来调控ETS-1。其他的转录因子,如Pax-5可以改变ETS-1的DNA亲和力。ETS-1含有两个磷酸化的位点,即苏氨酸-38及丝氨酸的第7外显子区。


由细胞外信号调节激酶1/2(ERKl/2)介导的磷酸化可以激活ETS-1,而由钙/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(CaMK II)或者肌球蛋白轻链激酶(MLCK)介导的Ⅶ外显子区的磷酸化则抑制了ETS-1的DNA结合活性。


微小RNA(miRNA)是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子,参与转录后基因表达调控。Du等发现miRNA-326可以通过作用于野生型ETS-1的3’端非编码区而抑制ETS-1蛋白的表达。此外,miRNA-326在CD4+T细胞内可以调节内源性ETS-1蛋白的量,但是并不影响ETS-1的转录。表明miRNA-326能够特异性的作用于ETS-1。


ETS-1在免疫细胞的分化及功能调控方面发挥了重要的作用。ETS-1可以调节T细胞的极化和分型。Walunas等发现,在ETS-1缺陷小鼠的胸腺、脾和肝脏中NK T细胞的数量显著下降,提示NK T细胞的形成需要ETS-1。


动物模型研究发现ETS-1敲除的小鼠会出现以高水平的IgM和IgG为特点的狼疮样疾病、免疫复合物介导的肾小球肾炎以及局部补体的激活。在ETS-1缺陷小鼠的血清中,自身反应性抗体的水平明显升高,尤其是针对自身抗原的自身抗体,如抗双链DNA、抗组蛋白、抗心磷脂和抗髓鞘碱性蛋白(MBP-Ab)抗体等。


Wang等在6~12周龄大的ETS-1缺陷小鼠的肾脏病理切片中发现了大量的IgG、IgM和补体C3。提示在ETS-1缺陷小鼠的肾脏中有大量的免疫复合物的沉积。也有研究发现与正常对照相比,SLE患者外周血单核淋巴细胞(PBMCs)中ETS-1 mRNA表达下降。另外,ETS-1同样也可以导致淋巴细胞的异常,通过影响Thl7以及B细胞的分化,进而参与SLE的发病。


研究发现,miRNA-146启动子区域的rs57095329位点与SLE的发瘸显著相关,该位点可以下调miR-146启动子区域与ETS-1结合的能力,从而导致SLE患者体内miRNA水平显著低于健康人。miRNA表达水平的下降可能导致I型干扰素通路的活化,有研究曾证实,I型干扰素通路的活化可以导致SLE的发生。


2 ETS-1对辅助性T细胞(Th细胞)免疫应答的调控作用


Th细胞在适应性免疫应答中发挥了重要的作用。在SLE患者体内,Thl细胞活性降低,Th2细胞活性增高而导致Thl/Th2失衡。


T-bet和GATA-3是Th1和Th2细胞分化过程中重要的转录调控因子,研究证实,与健康对照组相比,在SLE患者体内7-bet/GA7rA-3与干扰素-γ细胞介素(IL)-4 mRNA的相对表达水平显著升高,并且与疾病的活动性相关。


此外,通过检测狼疮患者皮肤角蛋白细胞内IL-2、IL-5、肿瘤坏死因子(TNF)-α仅和干扰素-γ mRNA的表达水平发现,47%的患者出现至少-种细胞因子mRNA表达水平的上升,IL-5和干扰素-γ的上升最显著,而出现上述细胞因子mRNA表达上升的患者皮损的程度也更严重。


以上研究表明,Thl/Th2失衡可能参与了SLE发病。T-bet不仅是Th细胞分化过程中重要的转录调控因子,同时也是干扰素-γ的反式作用子,可以促进干扰素-γ的产生,Grenningloh等发现,ETS-1可以协助T-bet共同促进干扰素叫的产生。


细胞内细胞因子染色发现,50%~70%的野生型Thl细胞IL-2和干扰素-γ染色阳性,50%~65%的野生型Th2细胞表达IL-10和IL4。IL-10是-种抗炎细胞因子,通常Thl细胞上不表达,但是在ETS-1缺陷的Thl细胞中有超过38%的细胞产生IL-lO。在ETS-1缺陷的Th2细胞内,IL-4水平也显著下降,而IL-l0产生水平却提高。


上述研究表明,体内ETS-1在Thl细胞介导的炎症反应中发挥了重要的作用。Th17细胞是-种新的CD4+T细胞亚群,与自身免疫病、肿瘤、炎症的发生发展有密切关系。


研究发现活动期SLE患者体内CD4+IL-17+T细胞数量较健康对照组明显上升,提示THl7细胞可能参与SLE的发病。wong等报道,在SLE患者体内IL-17水平显著升高且与SLE疾病活动指数(SLEDAI)呈正相关。


尽管Thl7细胞在-些自身免疫病的发病过程中所起的作用已经得到了证实,但是调控Thl7细胞分化的分子机制仍然不是十分清楚。


研究证实,IL-2对Thl7细胞的分化有抑制作用。Moisan等发现ETS-1敲除的小鼠IL-2水平下降、IL-2对Thl7细胞的抑制作用受损,导致ETS-1敲除的皿细胞更易向Thl7细胞分化,进而IL-17的产生水平也明显升高。


RORγt是Th17细胞分化的特异性转录因子,在ETS-1缺陷的Thl7细胞中RORγt水平明显升高。此外,在ETS-1缺陷小鼠的肺中IL-17转录因子的水平明显升高,在呼吸道的内皮细胞中IL-17依赖的黏液分泌增加。


上述研究表明ETS-1对Thl7细胞的分化有抑制作用。CDl27是IL-17受体上能够与IL-17结合的亚基,ETS-1可以特异性地识别并结合CDl27,ETS-1缺陷的T细胞CDl27表达水平下降,且IL-17信号途径受损,说明ETS-1可以维持外周血T细胞中IL-17受体的表达。miRNA-326可能参与调控THl7细胞的分化而与自身免疫病的发生有关。


Du等发现miRNA-326可能通过抑制ETS-1的表达而参与调控Th17的分化。敲除或过表达miRNA-326可以减缓或加重实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelifis,EAE)小鼠的病情,在自身免疫病患者的体内miRNA-326表达水平上调,并且其表达水平与疾病活动性及IL-17的产生水平相关。


说明miRNA-326可以通过调控ETS-1基因来影响Thl7细胞的分化,从而导致了自身免疫病的发生。


3 ETS-1调控调节性T细胞的机制


调节性T细胞是体内存在的-类具有免疫抑制功能的T淋巴细胞亚群。通过抑制效应性T细胞的功能维持自身免疫内环境稳定,调节性T细胞细胞的数量及功能异常导致自身免疫病、移植排斥反应和肿瘤的发生。


调节性T细胞细胞能够分泌IL_4、IL-10和转化生长因子(TGF)-β等细胞因子。在SLE患者中调节性T细胞细胞凋亡水平明显增加并且血清中TGF-β水平下降。


CD4+CD25+调节性T细胞可以通过抑制单核细胞和巨噬细胞分泌细胞因子来减轻机体的炎症反应和组织损伤,在活动期SLE患者外周血中CD4+CD25调节性T细胞显著低于稳定期患者。


在ETS-1缺陷的小鼠中出现了T细胞介导的脾肿大以及自身免疫病,而野生型小鼠调节性T细胞可以阻断脾肿大的发展。ETS-1缺陷的小鼠脾脏中出现大量活化的T细胞,包括Th2型CD4+T细胞,而调节性T细胞的比例下降,且调节性T细胞表达Foxp3的量显著降低。


体外研究实验发现ETS-l缺陷的小鼠脾细胞中的调节性T细胞抑制疾病发生的能力下降,并且能够导致机体发生T细胞介导的炎症性肠病。提示ETS-1是调节性T细胞发生过程中必须的转录因子,并且对于Foxp3的表达起到了调控。


Foxp3对于决定调节性T细胞的分化以及维持它的功能发挥了重要的作用,但是Foxp3是如何表达的以及这种表达是如何维持的,这-分子机制目前尚不清楚。


研究发现对调节性T细胞特异的非甲基化区域(TSDR)中富含CpG的片段进行甲基化可以调控F0xD3的转录活性。在体外,ETS-1可以通过依赖甲基化的途径特异性的结合到TSDR,而破坏TSDR上的ETS-1结合位点可以明显的降低TSDR转录增强子的活性。


此外,从体内分离出的调节性T细胞中ETS-1只与脱甲基化的TSDR结合而不与甲基化的TSDR结合。所以,ETS-1可能是某种蛋白复合物中的-部分,该蛋白复合物结合到TSDR中非甲基化的片段上,从而稳定了调节性T细胞上Foxp3的表达。


4 ETS-1对B细胞应答的调控作用


SLE的一个重要特点就是机体内产生大量的自身抗体,B细胞在SLE发病中扮演了重要角色,是SLE致病的直接参与者。B细胞通过膜相关抗原受体特异性捕获并递呈抗原,激活B细胞,产生大量抗体,SLE中致病性免疫球蛋白由B细胞过度活化转换成浆细胞产生。


研究发现,ETS-1在调控B细胞功能上有重要作用,敲除ETS-1可以使终末B细胞分化成为分泌IgM型浆细胞增加。与野生型小鼠相比,EIS-1缺路小鼠的B220+J脾脏B细胞数量不变。


野生型小鼠中浆细胞比例仅占2%甚至更少,而ETS-1缺陷小鼠的浆细胞占19%~34%,且ETS-1缺陷小鼠浆细胞中IgM表达及血清中IgM水平均显著上升,表明ETS-1缺乏时B细胞数量正常但却出现了大量分泌IgM的浆细胞。


Wang等从野生型,杂合子型及ETS-1缺陷型小鼠体内提取脾脏B细胞并培养72 h,然后利用酶联免疫斑点法(ELISPOT)分析各自向IgM分泌型细胞分化的比例,结果显示,在没有明显刺激条件下有0.2%ETS-1缺陷B细胞分化成为分泌IgM型细胞,然而在野生型B细胞中却没有发现分泌IgM型细胞。


提示ETS-1缺陷B细胞具有向IgM分泌型细胞分化的潜在倾向。近年来发现Tou受体(TLR)在自身反应性B细胞的活化中发挥了重要的作用,并参与了SLE的致病。


Wang等Ⅲ也发现ETS-1缺陷的B细胞对Ⅱ且9的刺激反应性较野生型B细胞提高了3~5倍,且促进了B细胞分化成为免疫球蛋白分泌型浆细胞。


终末B细胞分化成为分泌Ig型浆细胞受多种转录调控因子的调控,特别是B细胞介导的成熟蛋白-1(B lymphocyte induced maturationprotein 1,Blimp-1)。


ETS-1可以与Blimp-1相互作用,阻断Blimp-1的DNA结合活性并且降低Blimp-1抑制目的基因的能力但不影响Blimp-1蛋白的产生。ETS-1缺陷不仅影响终末B细胞的分化,同时也影响早期B细胞亚群的发展和功能。


通过对ETS-1缺陷小鼠研究发现,ETS-1缺陷B细胞分化功能受损,特别是原始B细胞向前体B细胞分化阶段,同时ETS-l缺陷的小鼠中B-1a B细胞和边缘区B细胞也缺乏。


B-1a B细胞具有天然抗体的自身反应性并且可以增强抗原递呈能力而与狼疮发病相关。此外边缘区B细胞可通过参与早期炎症反应并且能快速分化成为能分泌抗体的细胞而参与自身免疫反应。这些研究都证实ETS-1对B细胞应答有调控作用。


然而,Wang等发现ETS-1缺陷小鼠脾脏可能缺乏边缘区B细胞但是腹腔中B-1a B细胞数量正常,这种现象的原因尚不清楚,认为不同小鼠基因背景的不同可能造成了结果的差异。


类别转换重组(class.switch combination,CSR)或称同种型转换(isotype switch)是指一个B淋巴细胞克隆在分化过程中VH基因片段保持不变,而发生CH基因节段的重排,比较CH基因片段重排后基因编码的产物,V区相同而C区不同,即识别抗原特异性不变,而类或亚类发生改变,局部微环境和细胞因子可影响和调节免疫球蛋白类别转换重组。


在对抗原和细胞因子应答的过程中B细胞发生类别转换重组并分化成免疫球蛋白分泌型浆细胞。在经抗原刺激的B细胞中,干扰素-γ和IL-27可以活化转录因子Stat-l,并且可以诱导Iγ2a基因的转录导致IgG2a类别转换的增强。


在淋巴细胞内干扰素-γ和IL-27还可上调T-bet的表达,T细胞依赖性B细胞活化后T-bet可诱导其类别转换成为分泌IgG2a型的B细胞。体内及体外实验均发现,ETS-1的失活导致IgG2a分泌的严重下降。


Nguyen等利用大量的体内及体外实验证实,ETS-1可与Stat-1直接结合,协助Stat-1作用于T-bet增强子区域,参与Stat-l和T-bet介导的IgG2a抗原类别转换。


越来越多的研究证实,ETS-1在SLE发病机制中可能发挥作用。但是,目前的研究尚没有证据能够解释ETS-1通过何种分子途径参与SLE的发病,并导致SLE临床表现的个体差异。因此,为了更好地了解SLE的发病机制,需要对ETS-1进行更进-步的研究,特别是针对人体进行的研究。


中华风湿病学杂志2013年2月17卷2期

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