小荷才露尖尖角：囊性纤维化新兴靶向治疗（下）
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小荷才露尖尖角：囊性纤维化新兴靶向治疗（中）
基因治疗技术
基因替代治疗
CFTR基因克隆有望实现基因替代治疗（通过使用一种突变非依赖方式）在单基因疾病上的应用。然而，由于难以找到可以克服气道的物理和免疫防御机制的基因转换载体，早期进展并不顺利。由于囊性纤维化病人的气道存在增厚的分泌物和气流阻塞，基因治疗载体的雾化吸入形式尤其不适用。即使突破了这些障碍，也必须转换到气道上皮细胞的顶端表面，然后被转运到细胞核，进行翻译。
最初的基因治疗主要致力于腺病毒和相关腺病毒载体，尽管通过使用这种方式，CFTR mRNA已经表达出来，但是由于存在免疫反应，这种疗效多次使用后逐渐下降。新近，由于免疫原性的降低，人们已经将注意力放到非病毒载体。在双盲安慰剂控制试验中，人们将包裹着编码CFTR基因的质粒DNA的脂质体载体（像GL67）应用在囊性纤维化的病人，每周用药，4周后，没有出现免疫反应或者疗效降低的现象。
一个后期的双盲安慰剂对照试验对比了GL67-DNA 复合体和单独使用雾化GL67在16名患者肺部的作用。尽管出现了流感样的症状，但是依靠下呼吸道电势变化测试，试验发现治疗组25%的氯通道发生了复位，但是安慰剂组患者未发生变化(P<0.05)。后来的研究已经确定，表达在外源细菌或者组合病毒的质粒DNA——未甲基化CG 二苷核酸模体（CpG）是有免疫原性的，并且炎症也减少，如果应用不含CpG质粒（像pGM169），肺部的基因表达也更加持久。
为了克服囊性纤维化病人气道的不利生理环境，建于基因导入系统的综合纳米颗粒也在研究中。阳离子脂质体载体（带正电荷）的不足导致其和带有负电荷的粘液成分相互作用，因此会降低其渗透作用。由多p氨基脂类(PBAE) 组成的可生物降解多聚体在生理液体中具有稳定性，并且可以渗透到机体高粘性的粘液凝胶层，到达上皮细胞下层。在最近的一项临床前研究中，依靠于DNA纳米粒子的PBAE可以在体外穿透囊性纤维化病人的咳出痰粘液，并且在体内实验中，PBAE可以在小鼠肺内出现稳定的转基因表达，在基因导入系统中表现出优良性能。
基因编码
在缺损基因的原位进行基因校对和修正，而不是通过转基因互补的方式，是囊性纤维化的一种新型治疗方法。DNA编码包括在一个基因组中插入、替换以及删除基因（如“分子剪刀”——核酸酶造成的缺失）。将人工设计的核酸酶精确的引进到突变基因片段中，紧接着通过与野生型基因进行同源重组，这是新的潜在的治疗囊性纤维化疾病的一种策略。Cas9是一种可编码的DNA核酸酶，来自微生物适应性免疫防御系统短回文重复序列（CRISPR），它是CRISPR/Cas9 基因组编辑系统最具潜力的一种核酸酶，其某段RNA区域能与目标DNA互补，这能够保证将突变的等位基因与正常的分开。这项技术已经被用来修复在体外的小肠干细胞CFTR ，并且可以大致恢复CFTR的功能。
RNA编辑——RNA编辑可能是一种更容易的基因编辑方法，因为mRNA更容易得到，并且其编码效应更短暂，因此可以减少其他意想不到的基因的影响。最近研究用无义的寡核苷酸来代替缺失的mRNA。最近在 F508del突变的人中进行了一场随机化的人造的雾化RNA的寡核苷酸 QR-010安慰剂对照实验。优化CFTR密码子的整条mRNA传递链是前临床发展的一种新方法。
针对以CFTR缺失为基础的治疗方法的后期临床研究
CFTR增效剂
ivacaftor是一种口服的生物及生物药效应的CFTR增效剂，是第一个批准被用在囊性纤维化病例中的CFTR调节剂。在大于十二岁、至少单个等位基因III G5 51D突变的一类病例的随机对照试验研究也支持依法卡托的应用。一秒钟的用力呼气量（FEVJ）在基础状况下为40%—90%，除不用高渗的生理盐水外，所有的参与者都进行标准的治疗方法。与24周的安慰剂治疗进行对照，以FEV1/用力肺活量FVC的比值(FEV1%)来进行度量，有10.6%的绝对提高（(10.4% v -0.2%； P<0.001)），在经过两周的治疗之后，得到了很大的改善。这种改善一直持续到为期48周的实验结束。因为被实验人群和实验设计以及随着时间的标准治疗不同，而且与依法卡托有关的安慰剂的FEV1%的绝对提高与治疗囊性纤维化的其他安慰剂实验相比，提高得更多，因此交叉研究的比较必须谨慎。并且肺急性加重的风险急剧减少，症状和体重得到了改善，而且没有严重的副作用。在治疗的两周之内，汗氯离子（CFTR功能的标记物）也减少了50 mmol/L，低于了典型的囊性纤维化诊断所达到阈值的平均水平(<60 mmol/L)。
在6-11岁，至少一个G551D基因突变，中度肺疾病的儿童中进行的随机对照试验也显示了相似的结果（基础状态时的一秒用力呼气容积预计为40-105%）。有关依法卡托的研究后来又在6岁及以上的九种非G551D门控人群(G178R, S549N, S549R, G551S, G970R, G1244E, S1251N, S1255P, G1349D)中进行了研究（平均年龄22.8），这种病人在全球的肺囊性纤维化病人中占1%左右。 我们排出了G970R 突变的人群，因为此项研究中此种病人数量不够。与安慰剂进行比较，FEV1和汗液中的氯离子在治疗八周之后可观察到改善。并且改善程度和在G551D门控突变中应用依法卡托的相似。
作为结果，对于囊性纤维化6岁及以上的患者，有至少一个CFTR门控突变（G551D和8个和9个其它的门控突变，取决于不同的国家规定）的患者使用ivacaftor，得到了世界范围内调控机构的进一步认可。对2~8岁，体重8kg及以上的有一个CFTR门控突变的病人使用ivacaftor后进行开放标记、单臂、24周安全性及药代动力学研究的结果刚刚被报导，除了发现有肝功检测异常（5134；15%）外，每12小时50 mg和70 mg剂量的ivacaftor被视为是安全的，并且ivacaftor 在年轻患者组中的药物代谢动力学同在高龄患者组中的（药物代谢动力）相似。研究人员在一些次要终点指标上也取得了显著的进步，这些次要终点指标包括：汗液中的氯离子含量、体重及与基线（所有P<0.0001）有关的BMI。所以，ivacaftor在美国、欧洲国家和加拿大被批准应用于2岁及以上有选择性门控突变的患者。
安全性
虽然ivacaftor有良好的耐受性，且没有主要的安全隐患，但为了更好的了解长期使用ivacaftor 的安全性，在随机对照试验的Ⅲ期，一个为期5年的安全监测研究正在美国和加拿大进展，制药方提示：在给患者治疗前、治疗第一年每隔3个月以及治疗一年后每年都要进行肝脏转氨酶水平测定，因为曾有使用ivacaftor 的囊性纤维化患者被测得（肝脏转氨酶）水平增高的报导。但是，转氨酶水平升高和ivacaftor治疗之间的联系并不明确因为这些升高（的现象）在有过转氨酶升高病史的患者中更为普遍。
由于囊性纤维化患儿中也出现了白内障的报道，在这些服用了ivacaftor的患者中也应进行基线检查及随后的眼科检查。Ivacaftor是CYP3A9染色体P450，第3家族，A亚家族）的底物，所以当CYP3A抑制剂和诱导剂出现时，严格地药物-药物相互作用也是有可能的，制药方建议当出现CYP3A的强烈抑制剂（如酮康唑及其它azoles、clarithromycin）时应减少ivacaftor的剂量，不推荐配伍使用CYP3A的强烈诱导剂（如利福平、卡马西平、phenytoin）。
在有G551D突变的患者推荐使用ivacaftor后，（研究人员）开展了为期6个月的观测研究以期为治疗效用提供理论指导。在所观测的患者中，有一部分患者的粘膜纤毛清除率(通过γ-scintingraphy)显著提高，这证实了CFTR功能的提高导致了粘膜纤毛清除率提高这一理论。通过囊内窥镜检查，胃肠道的pH也随之升高，这提示CFTR氯离子和碳酸转运增高导致的胃肠碱化将促进营养的吸收并导致体重大幅增加。铜绿假单胞菌的集落形成率也降低，尤其是在有轻度肺脏疾病或微生物的间歇性生长，提示CFTR功能增加导致这些细菌被清除。（研究人员）对在2个随机对照实验中至少有一个G551D突变的患者进行非盲性扩展研究，该研究显示持续性治疗可长达144周而无新发现的安全隐患。对这些使用CF基础注册数据达3年的病人进行观察随访调查显示：相对于倾向得分匹配的F508del纯合子对照组，ivacaftor 可以使FEV1下降率达50%，提示了ivacaftor 有疾病修正效应。
尽管这些临床试验不包括有晚期肺部疾病（预计第1秒最大呼气容积<40%）的患者，在这些肺部疾病晚期病人中仍然看到了第一秒最大呼气容积得到改善（改善4-6%）、体重增加以及静脉注射抗生素剂量减少。使用ivacaftor的G551D突变患者的其他状况也得到改善，这些状况包括：呼气中一氧化氮水平升高、痰液中链球菌负荷量减少、粘液堵塞减少、支气管扩张以及利用计算机断层扫描（CT）观测到的鼻窦疾病症状减轻，此外还有正性肺外作用（胰岛素分泌增加、对囊性纤维化相关的糖尿病识别和肝脂肪变减轻）。
另外针对III级浇注突变，人们已在至少有一种IV级R117H突变的病人身上评估了ivacaftor的效果达六年之多，IV级R117H突变是一种与CFTR残余功能相关的突变。 世界范围的CF患者中出现 III级门突变的占到了约2%而且由于一种相关的剪切突变改变了基因表达，所以其临床症状是可变的。在一个历时24周的随机对照试验中，ivacaftor组病人的症状及汗液中的氯离子浓度都有了改善，但FEV1%预设值这项重要结果并没有显著改善，一个成年人的预设亚组分析除外。在另一个亚组分析中，ivacaftor 对较晚期病人（较低的FEV1% 预设值，铜绿假单胞杆菌感染，和第8内含子5T多肽变异）并没有更好的效果。尽管对整个研究群体而言不能满足其主要终点，但ivacaftor已被FDA批准应用于6岁及以上的有R117H突变的患者，而且它有可能对那些有更确定的肺部疾病的患者最有利。
CFTR矫正剂
作为对先前临床研究的后续研究，IIa 期研究发现CFTR矫正剂lumacaftor 对F508del 纯合子患者无临床效果，尽管汗液中的氯离子浓度呈剂量依赖性减少。为恢复病人的氯离子转运，一个将lumacaftor 和ivacaftor联合应用于F508del纯合子患者的II期研究因此被展开。此研究以纠正胞内的错误加工来增强F508del CFTR在细胞表面的定位及随后的强化来增强通道的开放都是被需要的为前提。分别单独使用四个不同剂量的lumacaftor 28 天后并没有临床效果。
实际上，对使用较高剂量的lumacaftor的组FEV1%的预计值的下降有一个剂量依赖的趋势，这与呼吸困难和胸闷的加重有关；这项发现后来被确定为一种偏离目标的不良事件，因为它的实验对象是健康的志愿者。当把 ivacaftor 加入到两个最高剂量的lumacaftor 中再进行额外的28天的实验，与对照组相比FEV1% 预计值有所升高，且报告中的呼吸困难和胸闷无进一步加重。经过56天的治疗期，FEV1 的绝对的改变是3-4%.对一群F508del 杂合子患者进行了同样的II 期实验，结果证明联合应用lumacaftor-ivacaftor 对他们没有临床效果。这表现出了一种基因-剂量效应而且表明了联合疗法对F508del无效除非第二种突变仅对ivacaftor有II期研究为两个相同的III期研究设定了阶段，用于评估lumacaftor-ivacaftor联合疗法对F508del 纯合子病人的疗效的III期研究最近刚被完成。
两个剂量的lumacaftor（600 mg 一天一次或者 400 mg 一天两次）合并使用ivacaftor（ 250 mg一天两次)被评估。研究，在这些实验当中吸入性高渗生理盐水可以被使用。在合并分析中，两种治疗剂量与对照组(3.0% and 2.5% v -0.3%)相比，FEV1%预计值有了尽管较小(~3%)但很有价值的升高。 除了较高剂量组有较少的肺部情况恶化的事件外，两种剂量的lumacaftor 的效果是相同的。两种剂量一般都能被很好地耐受，但正如在II期实验中看到的那样，在积极治疗组呼吸困难和胸闷加重的患者是个重要的例外。尽管不常见，但关于积极治疗组会导致肝脏功能异常这一严重的不良反应(7/371 人; 0.9%)的报道仍是增加的与对照组(0/371人; 0%)相比。在全部的七个病例中，中止或中断治疗后，肝功检测均有改善或回到正常水平。在这两个关键的III期研究结果的基础上，lumacaftor-ivacaftor联合剂成为第一种被批准应用于F508del纯合子患者的CFTR改正剂。
现在，第三阶段的发展计划正在评估一种处于研究中的称为VX-661的小分子（结构和lumacaftor不同的CFTR 中和子）和ivacaftor的联合应用。VX-661与lumacaftor（允许一天一次的剂量）相比有良好的药动学特征，并且与lumacaftor相比，VX-661表现出了更少的药物间反应，使得使用更少剂量的ivacaftor成为可能。此外，不像lumacaftor，VX-661在健康志愿者中不与支气管痉挛相联系。
两个二期研究已经评估了在 F508del纯合病人中VX-661与ivacaftor 联合运用的效果。前四周的安慰剂对照试验发现，在预期的FEV1%上有4.8% 的绝对提高，一天100gVX-661联合一天两次与安慰剂相关的ivacaftor(4.4% v -0.4%; P=0.01)。所有的四周实验的病人都再延长到八周（总共12周），并且治疗组的预期FEV%的组内提高与基线保持着明显的相关(3%; P=0.03) ，但是与安慰剂组相比较，这种提升又是轻微的(3% v 1%)。
将来会在VX-661三期项目中的四个组中，评估超过1000个病人。这个研究会包含一组突变两个F508del的病人以及一组突变一个F508del联合突变第二个等位基因的杂合子病人，该突变（第二个等位基因）会导致：
* 最小的CFTR 功能（例如I, II类）
* CFTR蛋白的控制缺陷（例如三类突变或者R117H），还有
* 残存的CFTR 功能
CFTR 通读剂
非盲试点研究已经显示，氨基糖苷类庆大霉素的局部和全身用药都可以增加囊性纤维化病人的氯离子 转运（基于鼻电位差测量; NPD），同时增加至少一个CFTR基因的无义突变。一项安慰剂对照交叉实验调查了庆大霉素对鼻上皮细胞的局部应用，它对对有一个或两个终止突变，或F508de突变纯合子患者进行了14天实验。和非盲试点研究的发现相似，NPD降低了，并且CFTR的表面表达在有终止突变的病人鼻上皮细胞升高了，而在F508de突变纯合子患者却未出现该现象。
在二期临床实验的非盲对照实验中，将Ataluren运用在至少一个无义基因突变的病例中，通过经上皮的NPD测量，结果显示CFTR活性有所改善。然而，另外一个研究没有成果。尽管在短期研究中，预期的FEV1%没有观察到明显的改变，但是一个长达12周的非盲研究中，结果显示有此改变倾向。
后来，在在232个病人中，进行了口服 ataluren的三期随机对照实验，实验发现，在实验组和对照组之间，48小时后预期的FEV1%的主要结果的相对变化并没有明显的不同。此外，在其他感兴趣的临床结果中并没有不同，包括体重、发作频率、症状、CFTR活动的生物标记物（汗液氯离子和鼻电位差测定）。除了在ataluren组关于肾损伤的报道明显增多(15% v <1%)之外，ataluren和安慰剂组的健康档案都是一样的。通常这些反应都是轻微的，但是4%的病人却因为血清肌酸酐增多而不得不停止治疗。一个预定的亚组分析发现没有接受慢性吸入妥布霉素维持治疗的病人（占研究人员的37%）预期的FEV1%明显提高，并且肺恶化率明显降低。后来的荧光素酶检测显示当细胞与氨基糖甙类共孵育的时候，减少的ataluren诱导了通读，而克利斯汀、氨曲南却不能。因此，一个三期的随机对照试验目前正在评估没有接受慢性吸入妥布霉素维持治疗(NCT02139306)的无义突变的患者的ataluren疗效。
基因替代疗法
一个用以评估含有CFTR cDNA的 雾化吸入式 腺相关病毒 载体的初始RCT显示：同安慰剂相比，该载体同肺功能呈正相关。但是该结果在较大的ⅡB期试验中并未出现。
UK CF 基因治疗组合主要致力于非病毒载体，并且通过一系列的Ⅰ 期和Ⅱ期研究了优化雾化吸入的质粒DNA-脂质体组合（被称为pGM169/GL67A）的构成与运输。
对140名有任意CETR突变组合的病人进行的间歇期为28天长达12个月的雾化吸入pGM169/GL67A盐溶液的ⅡB最近在英国完成。
这表示最大的囊性纤维化基因治疗实验到目前为止已经完成，并且它也是首次用于侦查临床相关肺部改变的实验。
可以进行常规治疗（除了DNA酶以外），因为DNA酶在用药前后的24小时内是禁止使用的。
该研究符合其首要终点:，治疗组在预计用力呼吸第一秒末的相对改变为3.7%(relative -0.4% v -4.0%； P=0.046). 证实治疗组相对安慰剂对照组结果有很大差异。
但是，治疗的效果主要是肺部功能的稳定而不是治疗的改善，因为在一年的研究末发现安慰剂对照组在预计第一秒呼气容积中有4%的相对下降。除了用力肺活量得到改善以及在治疗时利用电脑影像法捕捉气体的方法减少外，肺功能的其他测量方法、影像学表现及生活质量等次要末点未显示出明显的组间差别。
在下属小组分析中，有更严重的肺疾病患者(FEV1 估计值<70% )的治疗效果更显著，这表明气道沉积部位的不同对治疗效果有潜在的影响。虽然支气管潜在的不同的反应受安慰剂对照组而非治疗组的影响，但是支气管镜检的研究发现其结果依然支持积极治疗。虽然治疗结果收效轻微，但是治疗是安全的，除了一过性发热（可以用扑热息痛即对乙酰氨基酚治疗）外没有与治疗有关的严重副作用。这项研究显示基因治疗是有可能在囊性纤维化中起作用的，但是传递的载体及条件需要进一步优化以期提供更显著的临床治疗效果。
指导方针
欧洲囊性纤维变学会的最佳治疗准则中建议ivacaftor成为治疗有G551D突变的病人的标准的一部分，而美国囊性纤维变研究组织的肺部临床指引资料委员会则根据美国预防服务小组方案将ivacaftor指定为6岁及以上有至少一个G551D突变患者的A 级治疗方案（高度可观的治疗效果）。
尽管ivacaftor被一些世界上的调控机构批准用于非G551D门控突变的病人，且lumacaftor-ivacaftor被FDA批准用于同F508缺失突变同源的病人，但是国际囊性纤维化指南尚未更新来收录这些近期的批准。医生需要知道这些药物的资金花费效益，尤其是对于一些治疗效果无法确定的病人，尤其在花费昂贵的情况下。
精细医学：评价对CFTR的个体反映
由于一些尚未明了的机制，囊性纤维化患者对ＣＦＴＲ调控子治疗的反映不尽相同。尽管汗液氯离子含量被认为是可靠的生物指标或ＣＦＴＲ的功能读数并且对ＣＦＴＲ通过增强子和校正子作为单一试剂的调控敏感，个体反应仍然多种多样并且同预计第１秒用力呼吸容积等已确立的临床末点并不相关。
由于大多数已确诊的能造成突变的疾病是罕见的，所以实行随机安慰剂对照试验以指导所有患有该疾病的病人使用ＣＦＴＲ调控子是不可行的。因此迫切需要干预性ＣＦＴＲ生物标记和研究设计来预计或评估对ＣＦＴＲ调控子治疗的个体反应。
在亚临床水平上，来自囊性纤维化患者多能干细胞的初级支气管上皮细胞系和气道上皮细胞被用于体外来分析有特定突变患者的药物反应。最近以来，（研究人员）已经制造了利用起自患者直肠活检的肠道干细胞的干预性体外模型系统来复制体内组织构架。
当来自正常人的小肠类器官被cAMP激动剂毛喉素激活之后，类器官快速增大，并且这种增大完全是由CFTR介导的氯离子分泌所决定的，这种作用发生在类器官空腔的顶点膜处。与此相反，来自囊性纤维化的病人的类器官是不会发生类器官快速增大的。毛喉素所诱导的快速增大也可以通过在该模型系统中加入CFTR纠正剂来进行。小肠类器官因此是一项很有前途的CFTR功能检测试验，通过生物标记物反应的治疗选择，可以驱动精准化治疗进程。还有其他的方法，例如，在体外通过光学相干断层成像术分析人类的鼻气道细胞，发现也有可能包括离子转运和黏液清除的方式。
在临床水平上，用新型的临床设计，可以评估给病人运用CFTR调节剂的效果。在“N-of-1”研究中，利用对单个病人的临床实验的治疗来评估治疗反应。利用病人自身前后对照，并采用“开关”治疗循环来确保再现性。这种方法可以被用来成功的评估具有部分残余功能的CFTR突变的病人使用 ivacaftor的效果。
未来的研究问题
CFTR调节治疗的成功，引发了大量的新的、重要的临床研究问题：
应该多早进行治疗？
尽管ivacaftor在G551D和其他门控基因的突变病人的益处是引人注目的，但何时开始治疗还不清楚。短期的临床研究表明：ivacaftor对两岁的儿童也是安全有效的，但是是否能够用在新生儿身上还有待进一步研究。从AREST囊胞性纤维症新生儿筛查人群中得到是数据显示支气管扩张会在新生儿的开始几个月内，因此尽早的进行治疗对于防止肺的结构性病变具有重要意义。
CFTR调节剂的长期效应是什么？
纵向数据显示，ivacaftor能够修饰G551D突变病人的级数， 但是需要长期使用的益处和安全性数据。 与此相似，短期使用lumacaftor和ivacaftor的好处是有的，疾病的稳定性是个和重要的指标，特别是如果早期治疗的话，但是这些效应需要更长远的后期数据。
CFTR调节治疗的肺外益处是什么？
有证据表明，ivacaftor能够提高胰腺的内分泌功能，并且能够改善窦疾病。但是CFTR调节治疗是否允许一些慢性维护疗法安全停止，并减少治疗负担，这种负担对于许多病人来说通常是压倒性的。
对于F508del纯合个体才进行联合疗法是否可行？
在这些病人中，可能需要使用多重疗法来恢复CFTR的重要功能，因此，未来的研究要注重联合具有互补机制的不同调节剂，以此来促进CFTR的功能。尽管一些治疗方法是协同的，但是拮抗效应任然是存在的。例如，体外研究中，利用原始细胞或者细胞系，延长ivacaftor的使用，可能会减少纠正F508del的药物lumacaftor稳定性和表达。
结论
从1938年这个病被发现以来，囊性纤维化患者和他们的治疗者正在进入一个新的、充满希望的、乐观的和空古绝今的时代。1989年，CFTR基因的发现使得对CFTR负责结构和功能的理解成为了可能，为CFTR的调节提供了一种新的方式。 Ivacaftor和lumacaftor的最新认证代表了这个领域的精准医学新时代的黎明。这些药物对囊性纤维化的病人有积极的影响，并有可能使疾病得到改善。尽管要恢复所有病人的CFTR功能，还需要大量的研究，但是囊性纤维化的治疗领域正在加速前进，并且可以作为其他的基因疾病精准医学中的一个成功实践案例。
文献原文》》》New and emerging targeted therapies for cystic fibrosis