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血液肿瘤的综合诊断

血液病理学在过去的20年中得到了长足的发展,尤其是许多新技术的出现,使得该学科的亚专业化日趋明显。血液疾病的诊断传统上依据患者骨髓病理、淋巴系统病理结果以及出凝血异常而做出;而血液肿瘤的诊断需要在结合患者临床症状的前提下,综合形态学、免疫学、遗传学和分子生物学(MICM)的各种指标,以WHO血液肿瘤的分类标准为依据做出。在本文中我们就血液病理的诊断技术及其特征以及最新的相关进展进行简要概述。



一、血液病理诊断技术介绍

形态学是病理诊断的基础。造血系统的形态学检查必须同时提供骨髓活检、骨髓涂片和外周血涂片,其中骨髓活检可以提供的诊断信息包括骨髓的增生程度、是否有纤维化、三系造血成分(髓系、红系、巨核)的结构是否异常、三系中巨核细胞是否有病态改变、是否有急性白血病(AL)/淋巴瘤/骨髓瘤/转移癌侵犯骨髓、是否有微生物感染等形态学发现。骨髓涂片则更多提供三系中髓系和红系是否有病态造血的形态学特征。另外特殊染色包括骨髓涂片标本铁染色以及活检标本过碘酸雪夫染色(PAS染色)都是很重要的检查手段。需要指出的是,对骨髓的增生程度和巨核细胞病态造血的评估应该尽可能在骨髓活检标本上完成,因为这两个指标在骨髓涂片标本上的评估结果远不如前者可靠;而且骨髓增生的程度和年龄密切相关。骨髓活检的塑料包埋技术在特定历史条件下对骨髓形态学的评估起到了一定的促进作用,但是随着切片技术的发展以及免疫组织化学染色在病理切片上的广泛应用,石蜡包埋的切片应该成为组织学实验室的标准方法。

流式细胞术通过特异性单克隆抗体标记可对血细胞进行多参数测量,具有敏感度高、特异性强、快速、高效等特点。目前流式细胞术在血液病的应用主要包括白血病/淋巴瘤免疫分型、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)克隆、微小残留病、骨髓增生异常综合征(MDS)免疫表型、CD34+细胞计数等检测;对于某些遗传性疾病,如遗传性球形红细胞增多症、巨大血小板综合征、血小板无力症以及原发性免疫缺陷病等,流式细胞术亦有着重要的诊断价值;此外,在当今热门的细胞治疗中,各种免疫细胞亚群的检测也是通过流式细胞术来实现的。

遗传学方面,自1970年显带技术高速发展以来,大量的肿瘤相关遗传学异常被发现。据2014年8月Mitelman Database统计共报道64679例患者存在肿瘤相关异常,融合基因2094种。血液实验室的常规遗传学方法包括核型分析和荧光原位杂交(FISH)。核型分析的R带染色对染色体末端的改变比较敏感,而G带染色则容易发现染色体中间部分的变异。FISH则具有更高的敏感度但检查目标比较狭隘。为了弥补FISH在全基因组检测上的不足,在间期FISH的基础上逐步演变出多种新技术,如彩色涂染FISH、多色FISH(包括SKY-FISH、M-FISH、种间杂交彩色带型RX-FISH)、比较基因组杂交(CGH)以及在此基础上发展的array-CGH基因芯片技术。血液病是分子生物学渗透最深入、应用最早和最广泛的疾病,血液病中分子生物学检测技术主要包括PCR技术、测序技术和基因芯片等,在血液病的诊断分型、疗效评估、微小残留病的监测、预后判断及个体化治疗等多个方面均发挥了重要作用。基因芯片和二代测序技术已经开始进入临床实验室。由于技术的复杂性、高通量以及对生物信息学的依赖性,这两类技术还没有作为常规检查普及。

二、血液肿瘤的综合诊断

1.AL:

AL是一组在临床及遗传学上均有异质性的疾病,在诊断分型方面明确提出以遗传学为依据的伴随t(8;21)、t(15;17)、inv(16)/t(16;16)等重现性染色体异常的急性髓系白血病(AML)亚型以及伴随t(12;21)、t(1;19)、11q23相关易位、t(9;22)等遗传学改变的急性淋巴细胞白血病(ALL)亚型。在预后判断方面,不同的遗传学异常可以将AML和ALL进行不同的预后分层。基因的检测对AL的意义与细胞遗传学相同,融合基因RUNX1- RUNX1T1、PML- RARα、CBFβ- MYH11、MLL- AF9、ETV6- RUNX1、TCF3- PBX1、BCR- ABL等用以辅助诊断;NPM1、FLT3、CEBPα、c-KIT以及其他十几种相关基因的突变检测用于预后判断。总之,细胞和分子遗传学在AL诊断和预后判断方面起着至关重要的作用。

除了以上具有重现性遗传学异常的白血病类型外,AL的诊断还依赖于肿瘤原始细胞在骨髓和(或)外周血有核细胞中所占的比例,骨髓细胞计数包括原始细胞的评估应以镜下计数为准。

流式细胞术在AL检测中的意义在于:①系别鉴定和亚型的区分,其中在区分AML和ALL、系列未明的白血病类型、AL不能分类型和母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)的诊断中,流式细胞术具有不可替代的作用;②提示遗传学异常;③判断预后;④微小残留病监测,流式细胞术是目前监测微小残留病最有效的手段之一,操作流程简单,具有快速、高效的特点,适用于近95%的AL患者,灵敏度为10-3~10-4,如果采用多参数(6~10色)流式细胞术,灵敏度可以达到10-4~10-5。但是对于伴有骨髓纤维化和骨髓坏死的AL,流式细胞术的结果会受影响。

2.MDS:

MDS 8个亚型的诊断主要依据骨髓涂片中髓系细胞发育异常的系列和程度、原始细胞比例以及遗传学的异常。除了通过骨髓涂片来观察病态造血之外,通过骨髓活检可以发现组织结构的异常,包括出现不成熟前体细胞异常定位(ALIP)、前体红系细胞簇(常见于儿童MDS中的儿童难治性血细胞减少)和纤维增生等。需要特别指出的是,这些形态学特点可见于很多情况,并不是MDS的特异性表现,因此MDS的判定需要结合临床进行排除性诊断。

常规染色体核型分析是所有MDS疑似患者必做的检查项目之一。核型分析必须有可供分析的20个核分裂象才能作出判断,如不能获得足够核分裂象时,FISH检测(应至少包括5q31、CEP7、7q31、CEP8、20q、CEPY和p53等探针)是常规核型分析的必要补充。2015年NCCN指南中提到评估慢性粒-单核细胞白血病患者需要涉及5q31-33的染色体易位和(或)PDGFRβ基因重排。

流式细胞术用于MDS诊断是近十年来逐渐研究和深入的一个方向,虽然不同的中心和工作组研究的内容不尽相同,但结果基本一致,MDS患者骨髓细胞可能存在表型或数量异常,涉及CD34+原始细胞、粒细胞、单核细胞、幼稚红细胞、巨核细胞和B淋巴细胞祖细胞等,根据累及的异常表型数量进行积分,流式细胞术积分分值和MDS国际预后积分分值(IPSS)呈正相关。2015年NCCN关于MDS诊断治疗指南中,提到流式细胞术作为一项有效手段可以用于疑难MDS的辅助诊断。以上研究多为成人MDS患者结果,儿童MDS患者则与之有一定差异,但目前缺乏更多的资料。

由于MDS是一个累及多基因、多阶段的病理过程,随着全基因组测序技术的应用,越来越多的基因被发现参与MDS的发生及演变,其中包含两类重要的基因:①表观遗传调节子基因,如TET2、ASXL1、DNMT3A、EZH2等;②剪接体复合物蛋白编码基因,如SF3B1、SRSF2、U2AF1等。TET2是目前MDS中突变率较高的基因,突变率为12%~ 27%。虽然目前TET2突变对MDS的预后影响尚有争议,但有研究表明其突变可预测去甲基化药物治疗的疗效。SF3B1突变见于8%~20%的MDS患者,且在难治性贫血伴有环形铁粒幼红细胞患者中突变率高达84.8%,是该病的主要致病基因,伴有该突变的患者预后较好。

3.骨髓增殖性肿瘤(MPN):

骨髓中三系造血细胞的增生情况,特别是巨核细胞的形态与分布特征,对于诊断MPN以及分型具有重要的价值。与骨髓涂片相比,通过骨髓活检能够更好地观察巨核细胞的形态和分布。这对于MPN分型十分重要,在2008年WHO分类有关MPN的诊断标准中也有所体现。网状纤维染色可用于骨髓纤维增生程度的分级。若纤维增生呈显著、弥漫状态时,各种亚型的区分会十分困难。MPN好发于中老年人,儿童少见。与成人患者比较,儿童MPN的形态不典型。鉴于儿童MPN病例数少,对其临床病理学特点的认识尚需积累大宗病例进一步研究。

作为MPN中的代表性病种,慢性髓性白血病(CML)的特征性的分子标志为BCR-ABL融合基因,可以通过实时定量PCR法进行定期监测,来准确评估患者的疗效及预后。对于未达到预期疗效的患者,应进行BCR-ABL融合基因激酶区突变分析,其中T315I突变患者对第一代和第二代酪氨酸激酶抑制剂治疗均无效时,应选择行异基因造血干细胞移植治疗以防止疾病进展至急变期。

除了CML以外,长期以来MPN中其他亚型的诊断主要依赖于形态学的检查。直到2005年Baxter等首次报道JAK2/V617F,使得MPN的诊断进入到分子水平。JAK2/V617F也被列为2008年WHO分类的一项诊断标准。最近有研究者发现,联合检测JAK2、MPL、CALR、CSF3R基因突变,在MPN患者中的阳性率可达90%以上,从而使得MPN的诊断在形态学的基础上,增加了更加客观的分子诊断指标。

4.淋巴瘤:

随着多种检测技术的不断发展,对于淋巴瘤的认识在不断提高。淋巴瘤的表现形式多样,可以是实体瘤的表现形式,也可以是侵犯外周血和骨髓为主的白血病的表现形式。发生于髓外部位的淋巴瘤主要根据组织结构、细胞形态和免疫表型来诊断,而发生于骨髓的淋巴瘤主要依据细胞形态学进行初步的观察,并结合免疫表型及遗传学等进一步诊断与分型。

淋巴瘤的诊断和分类很大程度上依赖于免疫表型的特点,而免疫组织化学和流式细胞学在这方面起着重要的互补作用。相对于免疫组织化学,国内很多病理医师对流式细胞学在淋巴瘤诊断的应用还比较陌生。流式细胞学的优点更多体现在它的高敏感性、高特异性和较快的报告周期;而它的弱点则是无法与形态学结构相对应。此外流式细胞术检测浆细胞肿瘤的敏感性远低于形态学,这种情况下,肿瘤细胞的百分比应以形态学结果为准。由于小的活检以及细针穿刺在淋巴瘤诊断中的应用越来越多,流式细胞学在诊断淋巴瘤的作用也越来越大。需要注意的是,靶向药物的出现,使临床医师对淋巴瘤的诊断要求也从传统的形态学诊断,到开始强调免疫学和分子生物学的诊断。

比如,在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的诊断报告中,除了用CD10和MUM1来区分生发中心型和非生发中心型,还应该常规检查是否有MYC基因的改变;Burkitt淋巴瘤(BL)的诊断也需要MYC基因的检测;在慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤(CLL/SLL)的病理报告中,应该包括RB1、TP53、ATM等预后相关基因的表达状况;套细胞淋巴瘤(MCL)的诊断需要包括Ki-67的表达百分比;滤泡性淋巴瘤(FL)的病理诊断按照WHO的要求,应该包括FL的明确诊断、分级(1~2级还是3级)和生长方式(滤泡为主还是弥漫为主);ALL与霍奇金淋巴瘤如果有CD20的局部或者弱阳性,需要在报告中单独指出;两种灰区淋巴瘤的诊断要非常谨慎,由于这类淋巴瘤的罕见性,而且它们往往需要很多遗传学和分子生物学的辅助检查,建议通过科内会诊或者外送会诊。T细胞淋巴瘤中,除了血管免疫母细胞淋巴瘤、CD30阳性的T细胞淋巴瘤、侵袭性NK细胞白血病、EBV相关的T/NK细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤以外,其他T和NK细胞淋巴瘤的分类并不像B细胞淋巴瘤的分类那么清晰,而且很多时候如果不借助流式细胞术和基因重排技术,T细胞和NK细胞无法准确的鉴别。

发生于骨髓的淋巴瘤可以是髓外淋巴瘤侵犯骨髓,也可以是骨髓原发。淋巴瘤侵犯骨髓可有多种分布方式,小梁旁分布,特别是单纯的小梁旁分布,有利于FL的诊断;外周血出现绒毛淋巴细胞、骨髓活检呈窦内型分布,多提示为脾脏边缘区淋巴瘤;淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)虽称为淋巴瘤,但主要病变部位在骨髓,髓外部位很少侵犯;T大颗粒淋巴细胞白血病和侵袭性NK细胞白血病虽称为白血病,但侵犯骨髓的方式及程度与白血病不同,通常不表现为弥漫性浸润。近年来,关于骨髓的原发淋巴瘤有所报道,其定义为病变仅限于外周血和骨髓,无髓外部位侵犯的证据,以DLBCL最为多见,少数为FL和外周T细胞淋巴瘤非特指型。

通过采用流式细胞术对骨髓、外周血、淋巴结和脾脏等相关组织进行免疫表型和细胞克隆性分析(B细胞的轻链限制性表达和T细胞的TCRVβ检测),可以为淋巴瘤诊断提供有力的支持。包括小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、BL、T大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病等,由于具有相对特异的免疫表型特征,通过流式细胞术检测,可以提供较明确的诊断;而对于细胞体积中等甚至偏大的B细胞和更多的T细胞淋巴瘤,流式细胞术结果更多是作为形态学和免疫组织化学检测的重要补充。

在2008年版的WHO分类中有大量篇幅介绍各类淋巴瘤的遗传学改变,有些遗传学改变已经列入诊断标准之中。在福尔马林固定后的石蜡切片上进行FISH已经成为临床实验室的常规检查,包括MYC基因的FISH分离探针检查已作为BL的重要诊断和预后分析指标;MCL的主要遗传学改变是CCND1-IGH融合基因,而且FISH的检出率要高于PCR;FL的细胞遗传学标志是IGH-BCL2融合基因,其发生率达80%~90%;黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤中常见的遗传学改变包括3、7、12、18号染色体三体以及MALT淋巴瘤相对特异的t(1;14)、t(14;18)、t(11;18),这三种结构异常产生的相应融合基因分别为BCL10- IGH,IGH- MALT1,API2-MALT1;间变大细胞淋巴瘤的遗传学异常主要是ALK-NPM融合基因等。而双打击淋巴瘤的出现,则使得MYC和Bcl-2以及Bcl-6的FISH检测变得愈发重要。

关于预后意义的研究方面,CLL预后相关的遗传学异常包括13q14缺失(预后较好)、12号染色体三体(预后中等)、17p(TP53)缺失和11q22- 23(ATM)缺失(预后差)等。NCCN 2015年指南中,在多发性骨髓瘤诊断初期推荐应用FISH检测del(13)(q14)、del(17)(p13)、t(4;14)、t(11;14)、t(14;16)、1q21扩增。

由于其复杂的生物学行为,很多时候淋巴瘤仅仅依靠形态学和免疫表型难以准确鉴别,而此时分子水平的特异性改变就成为其诊断的关键依据。由于淋巴细胞成熟阻滞于某个阶段发生克隆性增生,因此所有的肿瘤细胞都具有相同的重排方式即克隆性重排。IG和TCR基因重排的分析已被公认为淋巴瘤诊断、鉴别诊断和疗效监测的重要指标。需要注意的是,淋巴瘤有相应的IG或TCR的克隆性改变,但克隆性的改变并不一定是淋巴瘤,这一特点在病毒性感染和年轻患者中尤其要引起警惕。另外,IG和TCR基因重排并不一定局限于B细胞或T细胞谱系,在T、B细胞淋巴瘤中存在谱系交叉。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族中的CD158a、CD158b和CD158e的限制性表达是NK细胞克隆性的重要标志,可用于反应性和部分肿瘤性NK细胞增生的鉴别。KIR应用的局限性在于CD158家族的复杂性和目前有限的CD158单抗之间的矛盾。此外,还有两个在B淋巴细胞增殖性疾病中相对特异的基因:BRAF V600E在毛细胞白血病和MYD88L265P在LPL中的特异性的突变。

三、血液病理诊断技术在其他血液疾病中的应用

1.骨髓衰竭性疾病:

诊断再生障碍性贫血(AA)、范可尼贫血(FA)、先天性角化不良症(DC)、Diamond-Blackfan贫血、Shwachmann-Diamond综合征等疾病时,骨髓活检更多是提供辅助性的证据,最终确诊需要结合临床表现以及实验室和相关的遗传学/基因检测。例如:除染色体断裂试验外,基因突变检测可为FA的诊断及鉴别诊断提供有力的证据,目前已经鉴定出15种FA基因亚型,其中以FANCA、FANCC及FANCG的突变比例最高。此外,研究人员还发现,ACD基因突变可导致AA发生;DKC1、TERC、TERT、NOP10、NHP2、TINF2、TCAB1等的突变与DC的发病相关。

2.红细胞疾病:

应用流式细胞术分别对红细胞和粒/单核细胞进行CD59和荧光标记的嗜水气单胞菌溶素变异体检测是目前PNH克隆检测的最可靠的方法,检测灵敏度可以达到1%,通过增加获取细胞的数量,可以将灵敏度提高至0.01%。此外通过流式细胞术对伊红-5'-马来酰亚胺(eosin- 5'-maleimide)标记的红细胞平均荧光强度进行检测,已成为诊断遗传性球形红细胞增多症的新手段,具有很好的敏感度和特异性。

3.造血干细胞移植:

流式细胞术在造血干细胞移植方面的应用主要包括:CD34+细胞计数用于检测造血干细胞含量;中性粒细胞CD64表达和单核细胞HLA-DR表达用于感染的预测和鉴别诊断;免疫细胞亚群检测用于病毒感染、移植物抗宿主病的鉴别诊断以及移植后免疫重建的监测等。

移植前的HLA配型、移植后的嵌合体的检测以及监测移植后微小残留病,都需要测序和PCR等技术来完成。此外,移植后感染严重影响患者的治疗效果,EBV、巨细胞等病毒是移植后最常见的感染病毒之一,及时检测病毒DNA,可有效减少并发症的发生。

4.出凝血疾病:

除了常规的出凝血相关检测以外,流式细胞术在出凝血疾病诊断中的应用包括:网织血小板检测、血小板膜表面糖蛋白检测、血小板自身抗体的检测等,为血小板减少疾病、心脑血管性疾病、血小板功能缺陷类疾病以及免疫性血小板减少性紫癜的诊断及鉴别诊断、疗效判断等提供重要依据。

四、展望

国内目前大多数医院的血液病检查分布在病理科、检验科和血液科等不同的实验室,导致血液疾病的诊断处于各自为政、缺乏沟通的状态,而不同专业的报告资质问题使这一现象更加复杂。2012年我院成立了血液病理诊断中心,第一次将病理学、流式细胞学、遗传学和分子生物学等学科整合为一个有机的功能和行政主体。与此同时,相关领域的专家也意识到血液病理发展的重要性,尤其是该专业专科医师的培训已经成为学科发展的主要制约瓶颈,今后血液病理的发展方向将会是多学科的综合、专科医师的培训及其与基础科研的密切结合,并需要在实验室的建设及质量控制方面形成一套完整的与国际接轨的制度。
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