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酪氨酸激酶抑制剂耐药的分子机制及耐药后治疗策略

作者:洪菲 闫志凌 徐开林(审校者)


酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的应用改变了慢性粒细胞性白血病(CML)的治疗模式,但TKI耐药是CML患者治疗失败的原因和难题之一,异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前临床中解决CML患者TKI耐药的手段之一。但是,移植风险、年龄及人类白细胞抗原(HLA)配型等因素限制了allo-HSCT的广泛应用。CML对TKI的耐药机制主要包括bcr-abl依赖性和非bcr-abl依赖性。bcr-abl依赖的机制包括bcr-abl过表达和bcr-abl突变。非bcr-abl依赖的机制包括药物摄取(hOCT1蛋白介导)、药物结合(如AGP,α-酸性糖蛋白)、三磷酸腺苷结合(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白介导的药物外排、DNA修复机制缺陷、异常信号通路(如Ras-Raf-Mek激酶、PI3K-Erk、JAK-STAT、Src家族激酶)的活化、表观遗传修饰(如Ⅰ类和Ⅲ类脱乙酰酶上调、组蛋白乙酰转移酶下调)和骨髓微环境等。


一、bcr-abl过表达


bcr-abl融合基因产物bcr-abl融合蛋白与ATP结合,持续激活下游信号通路,引起肿瘤细胞的持续增殖。bcr-abl过表达导致β-糖原合成酶基因剪切紊乱,增强了β-catenin活性和白血病细胞的自我更新能力。而Wnt/β-catenin信号转导途径是参与胚胎发育及肿瘤形成的重要信号转导途径,β-catenin是该途径中的关键环节,也是造血调控及多种肿瘤发生中的重要调节因素,尤其与bcr-abl的功能异常有关。因此,TKI阻断ATP与ABL激酶结合在bcr-abl过表达的患者中或许不能阻止疾病进展。目前研究认为,bcr-abl过表达与激酶区突变密切关联,无过表达时亦无激酶区突变。


二、bcr-abl激酶区突变


bcr-abl激酶区突变是导致耐药的主要原因,目前已发现的突变类型较多,在临床中常见的有T315I、M244V、G250E、Y253H、E255K、F317L、M351T、F359V及H396R,其中T315I占TKI耐药所有突变类型的4%~19%。由突变导致的耐药机制如下:(1)由TKI所含氨基酸改变导致的直接抑制,进而阻碍了TKI与激酶的结合,如T315I、F317L和F359C/V;(2)bcr-abl构象改变导致的间接抑制,进而间接阻碍TKI起效,如G250E、Q252H、Y253H和E255K/V;(3)维持bcr-abl活性的结构突变。而T315I突变导致结合位点"gatekeeper"形成,从而阻止伊马替尼与bcr-abl的结合,这是目前已知唯一一种对Ⅰ代TKI(如伊马替尼)和Ⅱ代TKI(如达沙替尼和尼罗替尼)都无反应的突变[6]。按照突变发生的频率,突变的种类包括点突变、复合突变以及多克隆突变,这些蜕变可以在治疗中形成,也可在治疗中潜伏,同一位置可以有不同的突变方式和作用方式,最终产生TKI耐药。根据ABL的晶体结构,可以将突变大致划分为4种类型:(1)P环突变(G250E、Q252H、Y253F/H、E255K/V),P环突变常见于进展期的患者,对于慢性期患者,发生P环突变的患者比未发生突变的患者更快出现疾病进展。因此,P环突变的发生意味着预后差和疾病的早期进展。P环突变导致CML患者对尼罗替尼耐药、对伊马替尼治疗无反应或治疗失败,可给予达沙替尼治疗;(2)伊马替尼结合位置突变(T315/F317)直接妨碍伊马替尼与催化结构域的结合;(3)催化结构域内突变位点(位点350~363)影响激酶活性;(4)活化环(A-loop)突变(位点381~420)阻碍激酶向非活化状态转化从而使伊马替尼失效。


虽然突变种类很多,但并非每种突变都会导致耐药。同一位点由不同的氨基酸替代(如F317C、F317L和F317V)产生的耐药性不同。不同突变患者预后不同,P环突变和T315I突变患者具有更差的无进展生存(PFS)期和总生存(OS)时间。O'Hare等发现点突变的OS和PFS明显高于双突变或复合突变,突变点位于P-loop上的患者OS和PFS最低,其次为T315I及无突变。


目前,针对T315I突变耐药逆转的策略主要包括:(1)普纳替尼为第三代TKI,对目前的abl激酶区突变均有作用,包括T315I、F317L、Y253H、F359V/C、E255K/V和V299L;其通过多位点同时作用,克服了单个突变位点的作用。目前研究发现,其对FLT3、FGFR、Src家族激酶、RET激酶以及Hedgehog通路均有作用,诱导了白血病细胞凋亡。PACEⅠ期及Ⅱ期试验发现,普纳替尼对经过多种治疗的CML患者,包括慢性期(CP)、急性期(AP)、急变期(BP)或Ph+急性淋巴细胞白血病患者有明显的抗白血病作用,超过90%的患者曾接受过至少两种TKI的治疗;(2)2015年2月英国Nature杂志发表论文证实阿昔替尼,一种当前被批准用于治疗晚期肾癌的TKI,可有效清除CML患者T315I突变的白血病细胞;(3)高三尖杉酯碱可抑制蛋白合成和促进细胞凋亡,Cortes等应用高三尖杉酯碱治疗TKI治疗失败或存在T315I突变患者的Ⅱ期临床试验中发现,对于慢性粒细胞性白血病慢性期(CML-CP)的患者,77%可获得完全血液学缓解(CHR),10%可获得完全细胞遗传学缓解(CCyR)。而针对其他主要类型突变的治疗方案见表1。

表1  abl激酶区突变治疗药物汇总


三、ABC转运蛋白介导的药物外排


ABC转运蛋白是广泛存在的跨膜转运蛋白,在肿瘤中广泛表达,肿瘤患者体内三磷酸腺苷结合转运蛋白B1(ABCB1)高表达与肿瘤细胞的多药耐药相关,可作为肿瘤患者预后的评价指标之一。研究发现,肿瘤细胞内药物浓度、细胞耐药程度均与细胞膜表面ABCB1的表达关系密切,而且阻断ABCB1可显著抑制药物外排,增加药物的胞内浓度,有效逆转细胞耐药,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。另一项研究发现,ABCB1中MDR1基因过表达产生的P-蛋白对伊马替尼具有外排作用;另外,ABCA3、ABCC2以及ABCG2基因编码的糖蛋白同样对伊马替尼、尼罗替尼以及达沙替尼具有拮抗作用。简而言之,TKI(包括伊马替尼、尼罗替尼以及达沙替尼)均为ABC的外排底物,但是,在药物高浓度状态时可克服其外排作用,抑制ABC外排泵的功能。


四、信号通路异常


bcr-abl下游的主要信号通路为磷脂酰肌醇-3/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)、JAK2/STAT5以及Ras/MAPK。N末端的coiled-coil结构域促进bcr-abl激酶的二聚化和自身磷酸化,有助于GRB2复合物的形成,该复合物可激活Ras和募集PI3K,Ras可活化MAPK促进细胞增殖,PI3K激活Akt信号,进一步增强SKP2、FOXO3以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号,从而促进细胞增殖;同时,bcr-abl基因直接或通过JAK活化STAT5促进细胞增殖。其中,各信号通路中的关键调节点的异常增强可增强各相关信号通路,从而提高了CML细胞的增殖能力。


PI3K/Akt活化主要与磷酸化、细胞质循环以及FOXO失活有关,导致CML细胞增殖和抗凋亡,针对其抑制剂包括LY36497、RI-BPI;激活JAK/STAT信号可促进细胞增殖、分化及移行,针对其抑制剂包括AG490、TG101209、HBC以及ON044580;TKI可增强MAPK信号通路,对CML祖细胞具有保护作用,抑制MAPK信号可阻断TKI治疗时对CML祖细胞的保护作用。目前,以上各信号通路抑制剂在CML中的作用研究仍处于临床前阶段,其对CML耐药的逆转作用将逐步被研究证实。


最近研究表明,间充质干细胞(MSC)可以通过调节CXCL12/CXCR4轴来影响CML细胞定向性迁移、黏附至骨髓腔,介导CML细胞的保护性休眠、活化众多促存活通路、抑制线粒体介导的CML细胞凋亡及通过上调抗凋亡基因bcl-6的表达介导耐药。此外,MSC还可以通过影响机体免疫等机制介导耐药。值得注意的是MSC还可通过CXCL12/CXCR4轴、N-cadherin以及Wnt-β-catenin信号通路等机制保护白血病干细胞免受TKI的作用,是CML耐药的重要原因之一。总之,MSC可通过众多机制介导CML耐药及病灶残存,为日后CML的复发埋下隐患。


五、造血微环境诱导的耐药


造血微环境诱导的耐药机制包括:(1)细胞-细胞接触、生长因子、炎性因子等;(2)在应激状况下上调与细胞存活和抗凋亡相关的基因;(3)维持低氧环境,此时细胞可上调EPO、血管内皮生长因子(VEGF)以及转铁蛋白的表达,使糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白增加,上调转化生长因子-β(TGF-β)表达,促进肿瘤增殖和转移,并且调节蛋白酶体表达。以上各微环境信号最终增强了白血病细胞的增殖和抗凋亡能力。造血微环境低氧状态是引起CML细胞耐药的重要机制之一,其中bcr-abl酪氨酸激酶激活TGF-β/Akt/FOXO信号,促进了CML增殖和抗凋亡。因此,TGF-β抑制剂(LY364947)可抑制CML细胞生长,而FOXO信号下游bcl-6抑制剂可使CML细胞处于活化状态,增加对TKI的敏感性。


六、DNA修复机制缺陷


DNA修复酶的缺陷以及白血病干/祖细胞的DNA不稳定增加了突变发生的概率,其中DNA修复酶在修复损伤或突变DNA中发挥重要作用;目前与DNA修复相关的酶主要包括NHEJ、SIRT1,该酶的缺陷或功能异常增加了突变的发生。目前,可用于克服DNA修复机制缺陷的方法主要包括poly (ADP-ribose)polymerase(PARP)抑制剂,它是定位在细胞核内、应激条件下DNA修复密切相关的一种酶;Sirtuin type 1(Sirt1)抑制剂是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白脱乙酰酶,为Sirtuins家族成员之一,与细胞增殖、分化、衰老、凋亡和代谢密切相关。


七、白血病干细胞


无论是CML还是急性白血病,均存在大量处于静止期的白血病细胞,这部分细胞具有超强的增殖潜能和对周期性化疗药物的不敏感性,从而导致这部分肿瘤细胞成为白血病不可治愈和复发的根源。目前研究认为,CML干细胞为非bcr-abl依赖性,因此,白血病干细胞是CML复发和耐药的根源。除此之外,停药后复发也是TKI治疗CML面临的另一个难题,这其中的一个重要原因是TKI能够有效靶向作用于增殖中成熟细胞,但不能清除白血病干细胞。


清除CML干细胞是目前热点研究方向之一。在CML干细胞维持相关的信号通路中,花生四烯酸5-脂氧合酶(Alox5)、Wnt/β-catenin以及Shh信号起重要作用。Alox5在CML细胞中上调,与CML发病密切相关,Alox5酶抑制剂Zileuton与伊马替尼联用对CML小鼠的OS较单用伊马替尼有更明显的作用;Wnt/β-catenin与CML干细胞的更新密切相关,其抑制剂包括Indomethacin、Av-65、GSK3;Shh相关蛋白(SHH、SMO和GLI1)与CML发生和维持有关,其蛋白SMO抑制剂包括cyclopamine、GDC-0449、LDE225、BMS833923、C14H12O3、GLI1抑制剂包括GANT61,这些抑制剂目前均处于研究阶段。


八、联合药物治疗TKI耐药


1.  CXCR4拮抗剂


肿瘤细胞表达趋化因子受体4(CXCR4)是一种7次跨膜G蛋白耦联受体。利用CXCR4拮抗剂,如plerixafor(AMD3100)靶向作用于CXCR4治疗白血病的机制主要是阻断肿瘤细胞与基质细胞之间的黏附作用,并将白血病细胞从对其有保护作用的基质中动员出来,使常规药物对其更有效。研究表明,与MSC共同培养的CML细胞对TKI的敏感性降低,当加用CXCR4拮抗剂时CML细胞对TKI的敏感性得到恢复,提示MSC可介导CML细胞对TKI产生耐药,且该机制主要是依赖于CXCR4介导的黏附作用。


2.  他汀类药物或Lyn酶抑制剂


TKI联合他汀类药物或Lyn酶抑制剂是减少CML对TKI耐药的有效途径[25]。研究表明,骨髓中的MSC可以通过释放细胞因子(如干细胞因子)来活化Lyn,脂质层中活化的Lyn与CXCR4连接,可恢复甚至增强CXCR4在质膜上的表达,使CML细胞对CXCL12所介导的趋向性迁移变得敏感[26]。MSC借此使CML细胞逃逸至骨髓微环境中,从而对TKI产生耐药。所以,脂质层的破坏和Lyn酶的抑制都可以破坏MSC介导的耐药机制。


九、结语


综上所述,TKI耐药的机制主要包括bcr-abl依赖性和非bcr-abl依赖性。目前,国内外学者针对TKI耐药机制和应对策略进行了大量深入的研究,研发出了一系列针对耐药机制的新药和治疗手段,给CML患者带来了希望,为将来克服TKI耐药提供了理论基础和实验依据。但仍有部分患者出现对治疗不敏感或最终产生耐药的情况,需要进一步探索可能的原因和潜在的机制,并经临床试验验证,并最终回归和应用于临床。


来源:白血病·淋巴瘤,2017,26( 6 ): 368-371

 

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