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鲍曼不动杆菌感染与免疫研究进展

来源:张瑞凌,冼盈,张扣兴。中国感染与化疗杂志,2017,17(2):224-227。


鲍曼不动杆菌属革兰阴性菌,不发酵糖、需氧球杆菌,有荚膜、菌毛,无鞭毛和芽孢。近年来,随着多重耐药、广泛耐药菌的流行,鲍曼不动杆菌成为了重要的医院感染病原菌。它与各种各样的感染包括:机械通气相关性肺炎、血流感染、皮肤和伤口感染、尿路感染等有关。尽管鲍曼不动杆菌感染具有非常重要的临床意义,但是迄今关于其发病机制的研究仍然较少。目前,鲍曼不动杆菌中发现的毒力因子主要包括外膜蛋白A(OmpA)、脂多糖(LPS)、荚膜多糖、磷脂酶D(PLD)、青霉素结合蛋白(PBP)和外膜囊泡(OMV),其发病机制的特点主要涉及运动性、黏附性、生物膜的形成和铁的获取。本文综述鲍曼不动杆菌与宿主的相互作用,重点强调了其与宿主天然免疫的相互作用以及致病机制的研究进展。


1.鲍曼不动杆菌与宿主的相互作用


1.1 鲍曼不动杆菌和上皮细胞的相互作用


上皮细胞是宿主防御微生物感染的第一道防线,鲍曼不动杆菌能够在人类宿主的皮肤和黏膜上皮表面黏附、定植,且不同临床分离菌株的黏附能力不同。研究表明ECII菌株比ECI菌株对人类支气管上皮细胞的黏附性更强,但在流行株和非流行株之间没有显著差异。一旦鲍曼不动杆菌附着在生物和非生物表面后,可以分泌胞外多糖,导致微生物群落生物膜的形成。不同临床分离菌株形成生物膜的能力也不相同。deBreij等发现ECII菌株比ECI菌株形成的生物膜更大,但流行株和非流行株之间,以及耐药菌与敏感菌之间形成的生物膜同样无大差异。鲍曼不动杆菌黏附于上皮细胞后,可以定植在细胞表面,形成生物膜结构,也可以侵入上皮细胞,产生促炎反应,诱导产生细胞因子、趋化因子和抗菌肽。研究证实,鲍曼不动杆菌与人类气道上皮细胞H292共孵育,可以诱导产生IL-6和IL-84;与人类肺泡上皮细胞A549共培养可以刺激产生IL-8和人类β防御素hBD;与人喉上皮细胞HEp-2共孵育可以诱导产生MIP-2、MCP-1、KC、TNF-β、IL-1β、IL-6;与口腔和皮肤上皮细胞共孵育可刺激产生人类β防御素hBD-2和hBD-38。在动物模型中,经气管接种鲍曼不动杆菌可导致小鼠肺部产生不同的病理损伤,并刺激产生趋化因子MIP-1a、MIP-2、KC、RANTES,促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12p40、IL-23、TNF-a,以及抑炎因子IL-10、IL-139。


1.2 鲍曼不动杆菌和免疫细胞的相互作用


鲍曼不动杆菌突破上皮细胞屏障后,可以与不同的免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞等相互作用启动早期免疫反应。同时,鲍曼不动杆菌诱导激活的天然免疫反应,刺激分泌趋化因子,募集大量免疫细胞至感染部位,诱导产生炎性因子,以及抗菌因子如防御素、抗菌肽、活性氧(ROS)和活性氮(RNS),从而消除入侵的病原体。临床研究表明,鲍曼不动杆菌是医院内中性粒细胞减少性发热患者分离的最常见的革兰阴性菌之一。实验研究也表明,鲍曼不动杆菌感染部位存在中性粒细胞和招募中性粒细胞的趋化因子;中性粒细胞颗粒提取物可以杀死不动杆菌的其他表型;小鼠经鼻感染鲍曼不动杆菌后,中性粒细胞可以迅速募集到肺部,并随着感染的清除而降至基线水平。除了中性粒细胞以外,巨噬细胞也是宿主防御病原体入侵的重要吞噬细胞。Qiu等发现鲍曼不动杆菌感染小鼠巨噬细胞J774A.1后,细胞因子、趋化因子和NO表达水平随着感染时间的增加而上升,其中IL-1β、IL-6、MIP-2、IL-10和NO在24h可达到或接近高峰,而TNF-α表达水平在4h即可达到高峰。Tsuchiya等也发现,正常小鼠经鼻接种107或108cfu鲍曼不动杆菌后,可以在3d内被清除。而使用单克隆抗体分别耗竭中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞后,感染小鼠的10d存活率分别为0、50%和83%。说明相比较于NK细胞和巨噬细胞,中性粒细胞对于清除鲍曼不动杆菌十分必要。该研究还证实了NK细胞是通过增加趋化因子KC的表达,参与中性粒细胞的募集而发挥宿主保护作用。


2.鲍曼不动杆菌与宿主的相互作用机制


鲍曼不动杆菌侵入宿主后,其病原体相关分子模式(PAMP)如LPS、肽聚糖等,可以被Toll样受体(TLR)和NOD样受体(NLR)等宿主细胞的模式识别受体(pattern-recognitionreceptors,PRR)识别,并主要通过NF-κB和MAPK通路,诱发大量趋化因子以及促炎因子的释放。近年来,部分研究开始揭示鲍曼不动杆菌的毒力因子,包括:LPS、OmpA、OMV、荚膜多糖、PLD和PBP的致病机制。


2.1 鲍曼不动杆菌LPS的致病机制


与许多革兰阴性菌一样,鲍曼不动杆菌LPS具有高度的免疫原。鲍曼不动杆菌LPS可以被TLR4及其受体CD14识别,激活NF-κB,分泌MIP-2、KC,随后招募中性粒细胞。值得注意的是,在LPS的3个组成部分(脂质A、核心多糖和O抗原)中,脂质A是激活免疫的主要部分。研究发现多黏菌素耐药的鲍曼不动杆菌其合成脂质A的基因(lpxA、lpxC或lpxD)突变,导致LPS表达缺失,并增加细菌膜通透性。尽管研究证实,多黏菌素耐药的鲍曼不动杆菌发生了LPS的缺失,而完整的LPS是细菌对血清杀菌作用的抗性(即血清抗性)和在宿主体内生存所必需,但部分多黏菌素耐药鲍曼不动杆菌依然可以保持适应性和毒力。显然,还有其他的免疫机制参与了鲍曼不动杆菌引发的炎性反应。目前为止,能够识别细菌磷脂壁酸的TLR2、能够识别CpGDNA的TLR9和能够识别细菌肽聚糖成份的NOD1/NOD2也被证实参与了鲍曼不动杆菌致病过程。


2.2 鲍曼不动杆菌OmpA的致病机制


鲍曼不动杆菌OmpA分子量大小为38kD(以前称为Omp38),是高度保守的外膜孔蛋白,在鲍曼不动杆菌黏附和侵入真核细胞、生物膜形成、血清抗性、免疫调节、外膜囊泡起源等方面起重要作用,是目前功能研究得最透彻的毒力因子之一。研究表明,纯化的OmpA可以作用于线粒体通过释放细胞色素C和凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor,AIF)以及在细胞核的DNA酶活性诱导细胞凋亡25-26。OmpA还具有免疫调节作用,OmpA刺激人类喉部细胞可以上调一氧化氮合酶(iNOS)以及TLR2的表达。在亚致死浓度,OmpA通过TLR2和MAPK、NF-κB通路激活树突状细胞,从而刺激CD4+T细胞向Th1分化。OmpA也参与了黏附和入侵真核细胞,在小鼠肺炎模型中,鲍曼不动杆菌ompA基因突变株感染小鼠的肺部病理损伤和血液中的细菌负荷明显高于野生株,说明OmpA与鲍曼不动杆菌感染引起的肺部病理损伤和血行播散有关。OmpA还参与生物膜的形成、血清抗性和细菌运动性,并与外膜囊泡的生物起源有关。最后,有证据表明,其他细菌蛋白质如Omp33-36也能够诱导宿主细胞凋亡。


2.3 鲍曼不动杆菌OMV的致病机制


OMV是革兰阴性菌普遍分泌的直径约220~250nm的球形微粒,包含外膜蛋白、LPS、肽聚糖、外膜脂质、DNA、RNA等成分。从某种意义上来说,OMV是一种PAMP复合物,可以作用于宿主的PRR,如:Toll样受体4(TLR4),启动促炎信号级联,导致细胞因子、趋化因子和抗菌肽的产生。鲍曼不动杆菌OMV可以传递致病因子至宿主细胞,引起细胞死亡,而不需要细菌与宿主细胞直接接触,还可以作为宿主天然免疫的有效激活物,参与病原体炎性反应及宿主的天然免疫过程。Jun等将鲍曼不动杆菌ATCC19606不同浓度(分别为1、5、10mg/L)的OMV刺激人类喉上皮细胞HEp-2,发现促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1a和MCP-1表达均升高,且除IL-1β外,其余细胞因子的表达均呈剂量依赖性增加。而用鲍曼不动杆菌活菌感染HEp-2细胞时,促炎细胞因子表达水平与5mg/LOMV刺激表达水平相当。皮下注射OMV的小鼠,肺部炎性因子同样表达增加,并出现早期炎性病变。我们发现鲍曼不动杆菌OMV对巨噬细胞RAW264.7以及肺泡上皮细胞A549具有很强的细胞毒性,可诱导释放大量炎性因子及趋化因子,且广泛耐药菌比非多耐药菌分泌的OMV具有更强的促炎能力,蛋白组学分析显示广泛耐药菌分泌的OMV中含有更多的毒力相关因子,如OmpA、EpsA、Ptk、GroEL等。其中,OmpA是OMV中含量最多的蛋白,OMV可以运输OmpA至宿主细胞,作用于线粒体及核酸引起宿主细胞死亡,而ompA基因敲除的菌株未见类似现象。


2.4 鲍曼不动杆菌其他毒力因子的致病机制


补体是血清中的一个主要杀菌成分,补体旁路途径可以杀死人类血清中的鲍曼不动杆菌。然而,鲍曼不动杆菌具有血清抗性,且不同的鲍曼不动杆菌菌株在人类血清有显著不同的增殖和生存能力。关于鲍曼不动杆菌血清抗性的机制还有相当大的争议。研究表明补体旁路途径抑制因子H失活、鲍曼不动杆菌释放LPS、青霉素结合蛋白PBP-7/8修饰肽聚糖等均可能参与了血清抗性。表面多糖和荚膜也可以保护细菌免受宿主血清中的抗菌成分损伤,并且部分鲍曼不动杆菌能够产生多糖荚膜。此外,为了应对鲍曼不动杆菌在宿主内的DNA损伤和氧化应激,DNA修复蛋白RecA也是细菌生存所需的。尽管不动杆菌属缺乏LexA同源物及细胞分裂因子sulA,从而被认为缺乏典型的SOS反应,但Aranda等发现鲍曼不动杆菌ATCC17978recA突变菌株对抗生素、紫外线、H2O2、热休克及干燥的敏感性均大于野生株。recA突变菌株还更易受到巨噬细胞损伤,且对小鼠的毒力比野生型低。最后,研究发现磷脂酶D能够影响鲍曼不动杆菌的血清抗性、对上皮细胞的侵入能力以及致病力。


3.鲍曼不动杆菌疫苗的研制


近年来,多重耐药、广泛耐药鲍曼不动杆菌在医院暴发流行,新型抗生素研发滞后,通过疫苗防治感染有望成为一种治疗手段,OmpA、OMV、灭活的细菌、荚膜多糖、PLD和PBP等被认为是良好的疫苗候选者,其中OmpA被认为是最有前景的一个,因为不同感染部位来源的不同鲍曼不动杆菌其OmpA的氨基酸序列均高度保守(>80%),并且与人类蛋白质同源性非常低。此外,OMV因为具有一些固有的特性如免疫原性、稳定性、佐剂活性等,近年来也受到广泛关注。在过去数十年里,大多数研究是描述了鲍曼不动杆菌感染的流行病学、危险因素、结局,或者旨在优化多重耐药菌感染的抗生素疗法,这些研究为鲍曼不动杆菌感染的流行病学和临床管理提供了重要的信息,但是并没有说明其成为越来越成功的人类病原体的潜在生物学基础。由于大多数鲍曼不动杆菌感染发生在重症监护病房(ICU)具有基础疾病的患者,并且研究发现小鼠的免疫状态能够影响鲍曼不动杆菌感染的发展和转归,表明宿主免疫反应的差异可能影响感染风险或严重程度,免疫调节治疗免疫缺陷患者不动杆菌感染的策略可能是有益的。但是目前为止,尚无不动杆菌疫苗进入I期临床试验,说明研制安全有效的鲍曼不动杆菌疫苗还面临很多难题,还需要对宿主与鲍曼不动杆菌免疫反应的机制进行更加全面的了解和研究。

 

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