小肽转运载体在分子靶向显像研究中的应用
作者：丁志超，涂蓉，海南医学院临床学院
随着近年来精准医学的提出，现代医学有了新的内容和发展方向。分子影像学是开展精准医学的载体和主要手段之一，是精准医学的重要组成部分。分子影像学是指借助于分子探针，运用成像设备（主要包括放射性核素成像、MRI、光学成像、超声成像及CT成像）实时观测活体细胞、组织乃至整个系统在细胞甚至分子水平发生的生理、生化事件。
与传统医学影像能够直观显示病变形态学结果不同，分子影像可针对特定分子的表达与活性和生物学过程进行显像。分子显像剂又称为分子探针，其具有3个基本要素：具体的靶点、能将对比剂带向靶点的转运载体及显像剂。本文主要对分子靶向显像剂中转运载体的种类和特点以及小肽转运载体在光学和MRI中的应用现状及发展进行综述。
1.转运载体的种类和特点
转运载体指能将显像剂运转到特定靶点的物质，具有与靶分子高度的亲和力和结合的特异性，其主要通过携带显像物质与靶向性物质偶联，利用抗原-抗体、受体-配体、特异蛋白、核酸链之间等结合的原理实现。转运载体从先前转运单个显像物质的单模分子成像发展到转运多种显像物质的多模成像，甚至是近年来的双模双靶点成像，使得分子靶向成像效果更佳。目前，进行分子靶向显影的转运载体主要包括小肽、多肽、蛋白、抗体、适配体等。虽然有学者在研究中验证了这些转运载体特异的靶向能力，但有研究发现了诸多不足：抗体、蛋白质体积较大，在活体内容易被网状内皮系统吞噬而无法到达靶区；单克隆抗体存在严重的免疫源性；适配体性能不稳定，重复性不佳。小肽转运载体由数个氨基酸组成，可将显像剂转运到特定靶点，其分子量小，具有良好的组织渗透性、代谢稳定性和快速性以及可耐受多种修饰等特点，是分子靶向成像的一个良好平台，具有良好的研究和应用价值。
2.常用小肽转运载体研究
在分子靶向显像研究中，分子成像靶点的选择是分子成像技术的关键环节。针对不同靶点小肽转运载体的结构不同，主要由相应靶点的结构特点决定。就小肽转运载体的靶点而言，主要集中在整合素家族、CD13抗原（APN）、低糖基化黏蛋白-1（underglycosylated mucin-1，uMUC1）、纤维蛋白（fibrin，Fb）、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）及其复合物纤维蛋白-纤维连接蛋白等。
2.1 靶向整合素受体的小肽转运载体研究
肿瘤血管生成依赖于血管内皮细胞的迁移和侵袭，主要受血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）和细胞黏附受体整合素的调节。整合素是存在于细胞间隙和基底膜上的一种能促进细胞黏附和迁移的细胞外基质蛋白受体家族，是由α和β亚基非共价键结合形成的跨膜异二聚体糖蛋白。在整合素家族中，整合素αvβ3在肿瘤血管生成和转移中作用最为广泛，研究也最为成熟。
整合素αvβ3在上皮细胞和成熟内皮细胞处于低水平，但在多种实体肿瘤（如骨肉瘤、胶质瘤、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌）细胞和肿瘤新生血管内皮细胞上高表达。整合素αvβ3又称为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）依赖整合素，能与含有RGD序列的细胞外基质蛋白特异性结合[。
基于此，Hu等以整合素αvβ3为靶点，小肽RGD为转运载体与显像剂荧光素/Gd-DOTAGA和二氧化硅纳米粒子结合，合成荧光-MR双模态纳米分子探针GD-MSNs-RGD并进行细胞和动物实验。荧光和MRI细胞（人恶性胶质瘤U87MG）实验发现靶向性分子探针GD-MSNs-RGD与整合素αvβ3有良好的特异结合能力。进一步对荷人恶性胶质瘤U87MG（αvβ3过表达）和人表皮癌A431（αvβ3低表达）裸鼠模型进行对照性实验，通过尾静脉分别注射分子探针1、6h后，T1加权成像靶向性探针GD-MSNs-RGD组U87MG肿瘤比A431肿瘤有明显强化（U87MG肿瘤是A431肿瘤强化信噪比的2.3倍），非靶向性探针GD-MSNs-PEG（无REG配体）组未观察到2种移植瘤强化。
通过细胞和动物实验均验证了靶向性纳米探针GD-MSNs-RGD对过表达整合素αvβ3移植瘤有更高的灵敏度和良好的靶向性。近年来，在整合素受体家族研究中，其他整合素受体成员也取得了一定进展。整合素αvβ6在正常上皮细胞和上皮良性肿瘤细胞中不表达或低表达，但在多种上皮来源的恶性肿瘤细胞中高表达，并与肿瘤侵袭和转移密切相关。Zhang等以整合素αvβ6为靶点，胱氨酸结合肽（cysteine knot peptide，R01）为转运载体与荧光染料Atto740结合，合成光声-荧光双模分子探针A740-R01，并对荷人上皮肿瘤A431（整合素αvβ6阳性）、人胚肾细胞293T（整合素αvβ6阴性）裸鼠模型进行对照性光声-荧光成像实验。
在注射A740-R011h后，靶向组（A431荷瘤鼠）移植瘤荧光信号强度是非靶向组（293T荷瘤鼠）的7.5倍，说明双模态分子探针A740-R01对整合素αvβ6特异的靶向性，为其他整合素家族成员靶向成像探针的开发拓展了思路。分子影像学成像效果受探针特异性、敏感性、通透性等多种因素影响。单靶点成像往往使分子探针与相应靶点结合不足；而在肿瘤生长过程中，其细胞表面往往有多种受体表达，这为双靶点双模态分子靶向成像的出现创造了条件。
杨蕊梦等以整合素αvβ3和胃泌素释放肽受体（gastrin releasing peptide receptor，GRPR）为双靶点，小肽RGD和蛙皮素（bombesin，BBN）为转运载体与油溶性量子点Q1605（quantum dots，QDs）、超顺磁性氧化铁（super paramagnetic iron oxide，SPIO）结合，合成磁性-荧光双模态分子探针RGD@BBN-lipo（QDs）-SPIO并进行细胞对比实验。MRI示RGD@BBN-lipo（QDs）-SPIOT2弛豫率是SPIO作为MRI对比剂T2弛豫率最低标准的8倍；普鲁士蓝和荧光成像示RGD@BBN-lipo（QDs）-SPIO可以灵敏地靶向整合素αvβ3和GRPR任何一个受体高表达的乳腺癌细胞（人乳腺癌细胞MDA-MB-435GRPR阴性，αvβ3阳性；人乳腺癌细胞T47DGRPR阳性，αvβ3降低）。由于其独特的优越性，相信会有更多优质的双模双靶点探针产生。
2.2 靶向抗原的小肽转运载体研究
CD13受体是T细胞表面的一种抗原，又称为氨肽酶N，以同源二聚体形式存在于细胞膜上。CD13在正常脉管系统细胞表面几乎不表达，而在血液系统恶性肿瘤和多种实体肿瘤细胞及其新生血管内皮细胞表面高表达，如肝癌、肺癌、乳腺癌、急性髓性白血病、纤维肉瘤等；小肽NGR（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp）可特异性地与肿瘤新生血管内皮细胞上的CD13受体结合。基于此，陈贤飞等以NGR为转运载体先后与荧光染料、Gd结合，分别合成荧光-NGR、双模态荧光-NGRGd分子探针，并进行体外细胞对照实验。实验组、拮抗组用HT1080细胞、对照组用HT29细胞；结果显示2种分子探针实验组荧光强度均高于对照组及拮抗组（2~3倍）；半定量对比分析结果显示差异有统计学意义；但其缺少动物活体实验进一步验证NGR的靶向性和相关性能的检测。
Li等同样以NGR为转运载体与荧光染料CY5.5结合，合成荧光分子探针Cy5.5-NGR2并对荷人纤维肉瘤HT-1080细胞（CD13过表达）小鼠模型进行对照实验。结果实验组（Cy5.5-NGR2）移植瘤肌肉荧光强度比是对照组（等量的NGR和Cy5.5-NGR2）的2.5倍，进一步验证了小肽转运载体NGR对CD13受体良好的靶向能力。靶向抗原的小肽转运载体研究中不仅有常用的NGR小肽，针对不同抗原也开发出一些相应的小肽转运载体。黏蛋白-1（Mucin1，MUC1）是一种高糖基化跨膜糖蛋白，几乎表达于所有黏膜上皮细胞。在正常黏膜上皮细胞表面起润滑和保护作用，在多种上皮来源恶性肿瘤中异常表达、异常糖基化。
uMUC1在多数腺上皮来源恶性肿瘤细胞上过表达，如结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。Wang等以uMUC1靶向肽EPPT为转运载体，合成由葡聚糖氧化铁纳米粒子、Cy5.5和EPPT聚合的双模态MN-EPPT分子探针，通过监测荷胰腺癌小鼠模型化学治疗后的变化来评估双模态靶向探针的靶向能力。实验组用吉西他滨进行化疗，对照组用等量生理盐水替代，分别在注射MN-EPPT前和注射24h后进行T2加权成像和荧光成像，并通过组织学和荧光定量PCR对两组移植瘤uMUC1的表达水平进行分析。T2加权成像结果显示，实验组和对照组化疗后第7周移植瘤开始出现信号强度差异，之后逐渐明显；荧光成像结果显示：与对照组相比，实验组在化疗10周后移植瘤开始出现荧光强度减低，14周后明显减低；组织学和荧光定量PCR结果显示：实验组移植瘤uMUC1的表达明显低于对照组，与影像学结果相吻合，说明靶向性探针MN-EPPT具有较高的靶向性和灵敏性，从而为分子靶向成像实验设计提供了一个新角度。
2.3 靶向纤维蛋白的小肽转运载体其研究
Fb是一类不溶于水的蛋白质，通常含有相同二级结构的多肽链。研究表明，血栓形成与肿瘤生长有关。血栓形成过程产生血凝，从而导致肿瘤细胞周围纤维蛋白和血小板沉积，纤维蛋白凝块可以通过促血管生成因子的作用促进肿瘤血管生成。在血栓和肿瘤中，即使微摩尔浓度的纤维蛋白也能与纤维蛋白靶向肽特异地结合，而不与血浆中纤维蛋白结合。基于此，Chaabane等以Fb靶向肽为转运载体与Gd结合，合成MR分子探针Gd-F，并通过细胞和动物实验来验证分子探针Gd-F的靶向能力，通过使用抗血栓药物来评估Gd-F对肿瘤位点上纤维蛋白变化的敏感性。T1加权成像示细胞实验中，人和小鼠血栓信号强度实验组（靶向性探针Gd-F）比对照组（Gd-HPDO3A）增强5~14倍；荷神经细胞瘤裸鼠模型动物实验中，实验组移植瘤信号强度比对照组增强6~10倍，肿瘤边缘和间质持续增强。
经抗血栓药物（华法林）治疗组比未作处理组肿瘤区强化面积减小，信号强度降低约1/3；从而证实了合成探针的特异靶向性和灵敏性，为监测肿瘤生长和抗血栓治疗中纤维蛋白的沉积创造了条件。
2.4 靶向纤维连接蛋白及其复合物的小肽转运载体研究
FN是一种存在于细胞外基质介导细胞黏附、迁移、损伤修复等过程的高分子糖蛋白。外结构域-B纤维连接蛋白（extradomain-B fibronectin，EDB-FN）是一种介导细胞黏附和迁移的高分子糖蛋白，是癌胚纤维连接蛋白（onfFN）的一种亚型。onfFN在肿瘤细胞外基质中非常丰富，在肿瘤形成、肿瘤血管生成及转移中起关键作用；九环肽（CTVRTSADC，ZD2）结构简单，无免疫原性，能与EDB-FN特异性结合。基于此，Han等以EDB-FN为靶点，ZD2为转运载体与荧光染料Cy5.5结合，合成荧光分子探针ZD2-Cy5并进行细胞和动物实验。细胞实验结果显示，ZD2-Cy5能与前列腺癌PC3细胞分泌的EDB-FN特异性结合；荷前列腺癌PC3小鼠模型对比实验结果显示，注射分子探针90min后，实验组（ZD2-Cy5）移植瘤明显强化，对照组（CERAK-Cy5，非靶向性）移植瘤未见强化；180min后实验组移植瘤信噪比是对照组的2倍；细胞和动物实验证实了ZD2-Cy5与EDB-FN结合的特异性，为前列腺癌精准诊断及非侵入性分子靶向显影剂的开发提供了依据。
肿瘤细胞外基质中纤维连接蛋白沉积形成的纤维蛋白-纤连蛋白复合物被证实能促进肿瘤增殖、血管生成和转移；环肽CLT1能特异性地与肿瘤组织中形成的纤维蛋白-纤维连接蛋白复合物结合，而不与正常组织中形成的上述物质结合；Tan等以纤维蛋白-纤维连接蛋白复合物为靶点，小肽CLT1为转运载体与Gd-DOTA纳米粒2代结合，合成MR分子探针CLT1-G2-（Gd-DOTA）并对荷人前列腺癌PC-3裸鼠模型进行对比实验。注射分子探针1min后，实验组[CLT1-G2-（Gd-DOTA）]有100%信噪比增加，而对照组[KAREC-G2-（Gd-DOTA），非靶向性]仅有8%信噪比增加，表明小肽CLT1转运载体特异的靶向能力，为前列腺癌的诊断及治疗后评估创造了条件。
3.展望
分子影像学是一个多学科交叉的科学。随着人们对分子影像认识的深入及纳米生物技术、微流体技术等相关学科的快速发展，分子影像学也有了长足的进步。作为分子影像学的重要组成部分，分子靶向显像运载体的开发应用也取得了进展。由于小肽转运载体分子量小，并具有良好的组织渗透性、代谢稳定性和快速性及可耐受多种修饰等优点，使其在转运载体的大家族中占有重要地位，对其研究及应用越来越广泛；然而，基于小肽转运载体的靶向探针也面临着一些问题，如代表性是否充分，与靶点结合效率情况，探针的重复性、细胞毒性等。随着分子影像学及相关学科的发展和高性能小肽转运载体的开发，预计将会逐步走向临床应用。
来源：中国医学影像学杂志2017年第25卷第4期